高 艷，崔文鈺，盧志強(qiáng)，崔廣智

（1.天津市兒童醫(yī)院，天津 300134；2.廣東工業(yè)大學(xué)，廣州 510006；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

糖尿病足是糖尿病患者的一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)病率高達(dá)25%[1]。糖尿病足潰瘍好發(fā)于足趾，燒/燙傷是最常見誘因[2]，其中以低溫燙傷（40～44℃）出現(xiàn)的機(jī)率更大[3]。由于糖尿病足患者普遍存在神經(jīng)病變，溫覺及痛覺等感覺功能減退、甚至喪失，不能及時(shí)感受到外源性高溫，易致燙傷。同時(shí)，病變的血管僅可維持皮膚組織的生存，無法對(duì)創(chuàng)傷和感染等做出自我保護(hù)，故對(duì)感染難控的糖尿病患者[4]而言，酷似患有創(chuàng)傷愈合衰竭癥[5]。

在臨床中已有報(bào)道應(yīng)用京萬紅軟膏治療糖尿病足效果良好[6-7]，糖尿病足和京萬紅軟膏主治的燒燙傷均具有脈絡(luò)瘀阻、血行不暢、電解質(zhì)紊亂、機(jī)體免疫力下降等共性[8]，京萬紅軟膏具有活血消腫、祛瘀止痛、解毒排膿、祛腐生肌的功效，將其運(yùn)用于大鼠糖尿病足燙傷的治療，評(píng)價(jià)其藥效并探究其作用機(jī)制，望為臨床上糖尿病足燙傷的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠60只：天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，體質(zhì)量200～220g。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 1）京萬紅軟膏（20 g，天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，批號(hào)：211692）。2）重組人表皮生長因子外用溶液（rhEGF，2000U×15mL，深圳市華生元素基因工程發(fā)展有限公司）。3）鏈尿佐菌素（STZ，sigma公司，S0310）。4）超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。5）Trnzol總RNA提取試劑盒，RNase Free Water（RT 121-01）、溴化乙錠（EB，RT 203）、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、FastSYBR Mixture（With ROX）試劑盒（北京康為世紀(jì)有限公司）。6）DNA Ladder Maker（寶生物工程大連有限公司，D526A）。7）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 美國強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖儀，HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司），足趾測量儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司，BW-YLS-7B），電動(dòng)勻漿機(jī)，DU-530紫外分光光度計(jì)（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美國），7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LifeTechnologies，F(xiàn)oster City，CA，USA），三恒電泳儀（EPC3000），多功能讀板機(jī)（Flex Station 3 型，Molecular Devieces），凝膠成像分析儀（Cuene Genins），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 糖尿病及糖尿病足模型的復(fù)制 選用Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量200～220 g。大鼠禁食后，據(jù)空腹體質(zhì)量以50 mg/kg的劑量腹腔快速注以無菌的檸檬酸緩沖液（pH 4.35）配制而成的1%濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的STZ溶液。1周后空腹血糖值大于16.65 mmol/L的大鼠視為糖尿病模型復(fù)制成功。

血糖達(dá)標(biāo)的大鼠喂養(yǎng)1個(gè)月后，復(fù)制大鼠糖尿病足燙傷模型。選用Wistar大鼠45只，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度為（60±1）℃，將大鼠左后足踝關(guān)節(jié)上方0.5 cm處做標(biāo)記，將其以下部分浸入熱水中，保持固定不動(dòng)，20 s后取出。2 h后大鼠左后足出現(xiàn)明顯紅腫、大水泡，表示深Ⅱ度燙傷模型復(fù)制成功 [對(duì)深Ⅱ度燙傷的定義為：已傷及真皮層，傷口愈合之后會(huì)留下疤痕，大且厚層的水泡蓋住廣泛的區(qū)域，相當(dāng)于瓦格鈉（Wagner）分級(jí)的 3 級(jí)][9]。

2.2 分組及給藥方法 造模后，按照大鼠體質(zhì)量、血糖及造模后瓦格納分級(jí)結(jié)果將45只大鼠平行分為3組：模型組、京萬紅軟膏組、rhEGF組，每組15只；另外15只大鼠作為假手術(shù)組進(jìn)行對(duì)照。造模后當(dāng)天按照體質(zhì)量開始給藥，假手術(shù)組、模型組均給予空白基質(zhì)（3 g/kg），京萬紅軟膏組給予京萬紅軟膏（3 g/kg），rhEGF 組給予 rhEGF（4 000 U/10×10 cm2），以無菌紗布包扎，每日1次，連續(xù)換藥14 d。

2.3 足趾體積 在大鼠左后足踩關(guān)節(jié)上方0.5 cm處做標(biāo)記，分別于給藥前、1、3、5 d后用足趾測量儀測量其體積，每只大鼠測量兩次，取平均值。

2.4 Wagner分級(jí) 記錄各組大鼠給藥前、5、10、14 d后Wagner分級(jí)結(jié)果。級(jí)數(shù)代表了足部潰瘍的程度，級(jí)數(shù)越小，足部損傷程度越小，越接近正常的組織。

Wagner分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[10]：0 級(jí)：皮膚完整；l級(jí)：表淺潰瘍；2級(jí)：深部潰瘍（影響軟組織）；3級(jí)：肌腱韌帶受損、深部膿腫；4級(jí)：嚴(yán)重感染、骨質(zhì)破壞、缺損、骨髓炎；5級(jí)：濕性或干性壞死、一般需截肢。

2.5 足部宏觀形態(tài) 分別于給藥前、給藥1、3、5、7、10、14 d后對(duì)各組大鼠足部進(jìn)行觀察并記錄圖像。

2.6 SOD、MDA與一氧化氮（NO）的含量 給藥14 d后，處死大鼠，將左后足踝關(guān)節(jié)上方0.5 cm標(biāo)記處以下的足部組織用8%的硫化鈉脫毛擦干取下，小心剔除骨頭，保留全部的皮膚組織制成10%組織勻漿備用。用酶標(biāo)儀測定SOD、MDA、NO的含量。

2.7 大鼠足部組織中血小板源性生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）mRNA 的表達(dá)情況 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測，首先提取RNA，提取總RNA用核酸蛋白分析儀260 nm測定OD值，計(jì)算其RNA含量。將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，后對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算PDGF、TGF-β mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。PCR引物信息見表1。

表1 PCR引物信息Tab.1 PCR primer information

2.8 數(shù)據(jù)采集 PT-PCR具體步驟參考FastSYBR Mixture（With ROX）試劑盒的說明，導(dǎo)出所有孔的CT 值，根據(jù) 2（-ΔΔCT）計(jì)算每個(gè)基因表達(dá)水平的倍數(shù)變化。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有顯著性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 足趾體積 給藥5 d后，模型組大鼠的足部多數(shù)不再完整，出現(xiàn)不同程度的斷足，故統(tǒng)計(jì)至第5天。給藥前，各給藥組的足趾體積與模型組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，足部皮膚均出現(xiàn)明顯的腫脹，大而厚的水泡覆蓋了整個(gè)足部。見表2。

表2 大鼠足趾體積的測量結(jié)果（±s）Tab.2 Measurement results of toe volume in rats（±s）mL

表2 大鼠足趾體積的測量結(jié)果（±s）Tab.2 Measurement results of toe volume in rats（±s）mL

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組京萬紅軟膏組rhEGF組動(dòng)物數(shù)12 12 12 12給藥前體積 給藥1 d后 給藥3 d后 給藥5 d后1.672±0.086**1.630±0.085**1.636±0.067**1.622±0.101**3.613±0.600 3.642±0.492 3.094±0.524 2.901±0.304 3.733±0.557 3.186±0.414**2.778±0.420*2.610±0.465*3.547±0.482 3.285±0.341*2.925±0.387 2.713±0.368

與模型組相較，給藥1 d后，京萬紅軟膏組可極顯著的減小足趾體積（P＜0.01），給藥3 d和5 d后，京萬紅軟膏組可顯著減小糖尿病大鼠的足趾體積（P＜0.05），說明京萬紅軟膏可明顯減輕組織充血和水腫，對(duì)創(chuàng)面組織具有較好的消腫作用。

3.2 Wagner分級(jí) 給藥前，各組大鼠足部損傷程度一致，足部均呈現(xiàn)大且厚層的水泡，全層皮層潰瘍，并侵犯深部組織，為Wagner分級(jí)的3級(jí)。給藥5 d后，與模型組相比，各給藥組分級(jí)結(jié)果差異無顯著性。給藥10 d后，模型組足部多為蜂窩組織與大膿腔，而各給藥組新生表皮修復(fù)迅速，具有明顯的好轉(zhuǎn)，與模型組相較，差異具有顯著性（P＜0.01）。給藥14 d后，模型組多數(shù)大鼠足部均出現(xiàn)肢端壞死，甚至斷肢。而各給藥組表皮完整，病灶修復(fù)良好，與模型組相較，差異具有顯著性（P＜0.01）。見表3。

表3 Wagner分級(jí)結(jié)果（±s）Tab.3 Wagner grading results（±s） 級(jí)

表3 Wagner分級(jí)結(jié)果（±s）Tab.3 Wagner grading results（±s） 級(jí)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組京萬紅軟膏組rhEGF組動(dòng)物數(shù)12 12 12 12給藥前 給藥5 d后 給藥10 d后給藥14 d后0.00±0.00**0.00±0.00**0.00±0.00**0.00±0.00**3.00±0.00 3.33±0.98 3.25±1.14 4.08±0.90 3.00±0.00 2.83±0.83 2.33±0.49**1.58±0.67**3.00±0.00 2.75±0.75 2.42±0.79**1.75±0.62**

3.3 宏觀形態(tài) 造模后各組大鼠足部形態(tài)無明顯差異，均呈現(xiàn)出大而厚的水泡。隨著給藥天數(shù)的增多，模型組潰瘍程度逐天加重，且水泡逐漸轉(zhuǎn)變成大膿腔，壞死組織增多，最后甚至出現(xiàn)斷肢。而京萬紅軟膏組、rhEGF組給藥后，腫脹體積逐日減小，對(duì)感染的控制、潰瘍及壞死組織的修復(fù)良好。見圖 1、2。

3.4 SOD、MDA、NO的測定 與模型組相比，京萬紅軟膏組、rhEGF組可顯著升高SOD的含量（P＜0.05），而對(duì)MDA和NO的含量無顯著性影響。見表4。

3.5 京萬紅軟膏對(duì)PDGF、TGF-β mRNA表達(dá)的影響 與模型組相比，京萬紅軟膏組可顯著的升高PDGF mRNA的表達(dá)（P＜0.05），rhEGF組可顯著升高TGF-β mRNA 的表達(dá)（P＜0.05）。見圖 3。

4 討論

京萬紅軟膏是由地榆、當(dāng)歸、黃連、黃柏、紅花等30余種中藥組方而成的純中藥制劑，在燒燙傷、皮膚創(chuàng)傷、術(shù)后切口感染、帶狀皰疹、褥瘡等皮膚損傷中均有不同程度的療效[11]，在臨床中可單獨(dú)或聯(lián)合運(yùn)用于糖尿病足的有效治療[12]，研究將京萬紅軟膏作用于大鼠糖尿病足燙傷模型，并探究其機(jī)制。

圖1 大鼠足部正面宏觀形態(tài)Fig.1 Macromorphology of the front of rat foot

圖2 大鼠足部背面宏觀形態(tài)Fig.2 Macromorphology of the back of rat foot

表4 SOD、MDA、NO 測定結(jié)果（±s）Tab.4 Determination results of SOD，MDA and NO（±s）

表4 SOD、MDA、NO 測定結(jié)果（±s）Tab.4 Determination results of SOD，MDA and NO（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組京萬紅軟膏組rhEGF組動(dòng)物數(shù)MDA（nmol/mg）SOD（NU/mg）6 6 6 6 NO（μmol/g）36.97±4.85** 0.55±0.23 5.35±1.14 21.58±6.44 0.64±0.16 4.39±2.47 29.60±7.44* 0.66±0.23 5.39±1.13 27.94±6.15* 0.59±0.15 5.12±1.18

圖3 京萬紅軟膏對(duì)PDGF、TGF-β mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Jingwanhong Ointment on PDGF and TGF-β mRNA expression

SOD是生物體內(nèi)清除超氧陰離子自由基的重要抗氧化酶，可有效地清除過量的氧自由基[13]，是參與氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。氧化應(yīng)激的產(chǎn)生是由于自由基的劇增與體內(nèi)抗氧化最大清除限度的失衡。當(dāng)機(jī)體處于高糖狀態(tài)時(shí)，氧化產(chǎn)物蓄積，過多的自由基可使抗氧化成分SOD發(fā)生過氧化，使之滅活并驟減，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致組織與細(xì)胞損傷，糖尿病足創(chuàng)面難以愈合。可見，提升糖尿病足創(chuàng)面處SOD的含量是促進(jìn)其愈合的關(guān)鍵指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，京萬紅軟膏組可顯著升高糖尿病大鼠燙傷足部的SOD含量，提示了京萬紅軟膏組能促進(jìn)大鼠足部燙傷后潰瘍的愈合、減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、起到改善病情的作用很可能與清除過量的氧自由基相關(guān)。

TGF-β可趨化成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙與增殖，此外，在新生肉芽組織、膠原的形成過程中起關(guān)鍵性作用[14]。本研究中，rhEGF組可顯著升高TGF-βmRNA的表達(dá)（P＜0.05），可見rhEGF組創(chuàng)面修復(fù)等生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮可能與上調(diào)TGF-β mRNA的表達(dá)相關(guān)。

糖尿病足患者多有血管、神經(jīng)病變，足部創(chuàng)面常伴隨氧化應(yīng)激、糖基化終末產(chǎn)物、炎性因子等微環(huán)境異常，這些因素不但使創(chuàng)面遷延不愈，同時(shí)也引起PDGF等與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)的生長因子的含量及生物活性的下降[15]。PDGF可與靶細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，產(chǎn)生各種重要生物學(xué)效應(yīng)。對(duì)于平滑肌、內(nèi)皮等細(xì)胞，具有調(diào)控靶細(xì)胞增殖、遷移和分化的作用；對(duì)炎性細(xì)胞、中性粒細(xì)粒、巨噬細(xì)胞等具有趨化作用，此外，可誘導(dǎo)磷脂酞肌醇和花生四烯酸的釋放，參與前列腺素、細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)肉芽組織的生長[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，京萬紅軟膏組具有促進(jìn)PDGF mRNA表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)（P＜0.05），可見在糖尿病大鼠燙傷的足部組織中，傷口的愈合作用很可能與PDGF mRNA的生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮相關(guān)。

京萬紅軟膏針對(duì)大鼠糖尿病足燙傷，通過促進(jìn)表皮消腫、控制感染、祛除壞死組織等達(dá)到創(chuàng)面修復(fù)目的，可顯著升高潰瘍組織中SOD的含量和PDGF mRNA的表達(dá)，提示京萬紅軟膏對(duì)糖尿病足的愈合作用可能與消除過量的氧自由基，調(diào)控與創(chuàng)面愈合及組織修復(fù)具有重要作用的修復(fù)生長因子血小板源性生長因子PDGF相關(guān)，值得在臨床上應(yīng)用及進(jìn)一步研究。