平 靜 南春紅 王思源 岳志軍

兒童清熱口服顆粒劑是臨床上常用的治療藥物，主要由金銀花、滑石、蟬蛻、大黃、赤芍、板藍(lán)根等組成，以蔗糖為輔料，具有清熱解毒、解肌退熱作用[1]?，F(xiàn)代藥理結(jié)果表明[2]：兒童清熱口服顆粒劑用于內(nèi)蘊(yùn)伏熱、外感時邪引起的高熱不退、煩躁不安及大便秘結(jié)等癥中。但是，臨床上不同廠家兒童清熱口服顆粒劑質(zhì)量存在明顯的差異性，盡管能改善患兒癥狀，但是不同廠家藥物有效性、安全性不同。高效液相色譜法簡稱HPLC，是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，以高壓輸送流動相，采用高效固定相及高靈敏度檢測器，發(fā)展而成的現(xiàn)代液相色譜分析方法[3]。因此，本實驗首次建立HPLC同時測定兒童清熱口服顆粒劑中3種有效成分含量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司)；KQ-500E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XP205電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；0.45 μm微孔濾膜；進(jìn)樣針；移液管；注射器；托盤天平。

1.2 試劑 兒童清熱口服顆粒劑，批號：14262461、14261321、14261877；色譜乙腈(濟(jì)南普萊華化工有限公司)(批號：20130318)；純凈水(自制)；磷酸等化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 采用HPLC法，色譜柱為：Kromasil C18色譜柱為(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫0～7 min，10.0%A；7～12 min，10.0%～20%A; 12～13 min,20.0%～30%A; 13～26 min,30%～65%A; 26～35 min,60%～70%A; 35～45 min,10%A。線性洗脫檢測波長0～18.5 min，327 nm; 18.5～20 min, 238 nm; 20～23 min, 321 nm; 23～45 min, 280 nm，設(shè)定流速為1.0 ml/min；柱溫為28 ℃，選擇波長切換技術(shù)在其最大吸收波長部位檢測綠原酸(波長327 nm)、芍藥苷(波長230 nm)及黃芩苷含量(波長280 nm)[4]。

2.2 對照試驗的配置 精確稱取對照品劑適量，加甲醇溶解配置成濃度為0.1020 mg/ml綠原酸、芍藥苷、黃芩苷混合對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精確稱取兒童清熱口服顆粒劑適量，置具塞錐形瓶中，按料液比為1∶20加入80%的乙醇，超聲2次提取，溫度60 ℃，時間50 min，過濾，合并濾液，蒸干，加入20 ml蒸餾水溶解，加入(20 ml，20 ml)的正丁醇萃取二次，取正丁醇層，旋干，加入少量甲醇溶解，分別置于10 ml的容量瓶中，加入甲醇定容，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品。

2.4 精密度實驗 取兒童清熱口服顆粒劑連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行測定，分別對共有峰保留時間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計，計算RSD值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的相對標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，因此，結(jié)果表明該儀器具有良好的精密度。見表1。

2.5 穩(wěn)定性實驗 取兒童清熱口服顆粒劑按照2.1含量測定的色譜條件分別上樣(8、10、12、14、16、18、20 μl)，以上樣量和峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表2。

表1 精密度考察結(jié)果

表2 穩(wěn)定性實驗考察結(jié)果

結(jié)果顯示：兒童清熱口服顆粒劑中綠原酸回歸方程：Y=20.662X+19.211，R2=0.9994，R=0.9997；芍藥苷回歸方程：Y=4.56194×107X-0.00247367，R=0.9999，R2=0.9998；黃芩苷回歸方程：Y=5.59922×107X-0.002392863，R2=0.9997，R=0.9998。

2.6 重現(xiàn)性實驗 取兒童清熱口服顆粒劑3號供試品5份，按照供試品溶液的制備方法和色譜條件進(jìn)行測定，統(tǒng)計各共有峰的保留時間和峰面積，計算RSD值。結(jié)果表明它們的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，因此表明該儀器的重現(xiàn)性良好。見表3。

2.7 穩(wěn)定性實驗 取兒童清熱口服顆粒劑供試品，在0、2、4、8、12 h依次進(jìn)樣測定，統(tǒng)計各共有峰的保留時間和峰面積，計算各共峰的RSD值。結(jié)果表明它們的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，因此說明該儀器在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。見表4。

表3 重現(xiàn)性考察結(jié)果

表4 穩(wěn)定性考察結(jié)果

3 結(jié)果

兒童清熱口服顆粒劑中，14262461批號綠原酸含量為2.350 mg/g，芍藥苷含量0.7152 mg/g，黃芩苷含量3.7025 mg/g；14261321批號綠原酸含量為2.172 mg/g，芍藥苷含量0.8571 mg/g，黃芩苷含量3.853 mg/g；14261877批號綠原酸含量為2.639 mg/g，芍藥苷含量0.7934 mg/g，黃芩苷含量4.152 mg/g。見表5。

表5 樣品中綠原酸、芍藥苷及黃芩苷含量

4 討論

中藥復(fù)方制劑成分較為符合臨床上建立多指標(biāo)成分測定、合理可行的指紋圖譜相結(jié)合的質(zhì)量控制及生物檢測方法成為當(dāng)前研究的熱點，其中多指標(biāo)成分測量是中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的核心[5]。兒童清熱口服顆粒劑是臨床上常用的治療藥物，主要由金銀花、大黃、蟬蛻、石膏、板藍(lán)根、羚羊角等組成，能發(fā)揮清熱瀉火、解肌退熱功效[6]。目前，臨床上對于兒童清熱口服顆粒劑其治療標(biāo)準(zhǔn)多以草酸銨試液法鑒別石膏，并借助硅膠G薄層色譜法鑒別大青葉、相對密度及pH值等，但是臨床上對于兒童清熱口服顆粒劑有效成分測量方法研究較少[7]。本研究中，兒童清熱口服顆粒劑中，14262461批號綠原酸含量為2.350 mg/g，芍藥苷含量0.7152 mg/g，黃芩苷含量3.7025 mg/g；14261321批號綠原酸含量為2.172 mg/g，芍藥苷含量0.8571 mg/g，黃芩苷含量3.853 mg/g；14261877批號綠原酸含量為2.639 mg/g，芍藥苷含量0.7934 mg/g，黃芩苷含量4.152 mg/g，說明HPLC法用于兒童清熱口服顆粒劑有效成分是可行的，能了解不同批次下兒童清熱口服顆粒劑的有效成分，有助于提高臨床用藥安全性。綠原酸是金銀花的重要成分之一，具有抗菌、抗病毒等作用，易溶于乙醇、丙酮，藥物成分與咖啡酸相似，口服或腹腔注射時能提高機(jī)體中樞興奮性，能發(fā)揮利膽、抗菌作用，亦可用于氣喘、皮炎中。芍藥苷主要源于芍藥科植物芍藥根、牡丹根中，具有擴(kuò)張血管，發(fā)揮鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗炎抗?jié)兗敖鉄峤獐d及利尿作用[8]。同時，芍藥苷對心血管系統(tǒng)亦可發(fā)揮良好的效果，具有擴(kuò)張冠狀動脈，提高冠脈流量作用，藥物亦可抑制血小板及降低血壓作用。黃芩苷是從干燥根中分離、提取的一種黃酮類化合物，具有顯著的生物活性，能發(fā)揮抑菌、利尿、抗炎等作用，亦可發(fā)揮抗血栓形成、瀉火解毒、止血及解痙作用，能實現(xiàn)某些疾病的調(diào)節(jié)作用[9]。綠原酸、芍藥苷及黃芩苷是兒童清熱口服顆粒劑中有效成分，能發(fā)揮清熱解毒作用，但是臨床上對于其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)研究較少。HPLC又稱為高速液相色譜、高分離度液相色譜，是色譜法中的重要分支，以液體為流動相，利用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑等裝有固定相的色譜柱，置入檢測儀后能實現(xiàn)對樣本的測定。臨床研究表明：HPLC用于兒童清熱口服顆粒劑中具有高壓、高速、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣及柱子能廣泛使用等優(yōu)點，測定時所需的樣本量相對較少，能較為準(zhǔn)確地反映兒童清熱口服顆粒劑有效成分，有助于指導(dǎo)臨床用藥[10]。從本研究結(jié)果看出，不同批次的兒童清熱口服顆粒劑不同有效成分存在明顯的差異性，應(yīng)建立兒童清熱口服顆粒劑統(tǒng)一藥物標(biāo)準(zhǔn)，提高藥物有效成分劑量，提高臨床用藥安全性。同時，醫(yī)院購置藥物時應(yīng)定期監(jiān)測藥物批次，做好相關(guān)藥物的抽查工作，提高藥物含量，保證臨床用藥安全性。

綜上所述，HPLC法用于兒童清熱口服顆粒劑中3種有效成分含量測定，具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，可用于兒童清熱口服顆粒劑的質(zhì)量控制。