劉銀蘭，李國(guó)勤，葉 軒，李浙烽，徐二華，馮佩詩，顧天天，田 勇，李 昂，盧立志*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350000；3.浙江省仙居種雞場(chǎng)，浙江仙居 311719；4.杭州康德權(quán)飼料有限公司，杭州 311107）

雞蛋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[1]，且富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，其雞蛋中所含氨基酸在體內(nèi)的利用率高達(dá)99.6%，是天然食品中最理想的優(yōu)質(zhì)蛋白源[2]。近年來，隨著人們消費(fèi)水平及對(duì)食品認(rèn)識(shí)的提高，具有合理營(yíng)養(yǎng)和保健功效的功能性食品逐漸被消費(fèi)者關(guān)注和青睞，而具有良好藥食同源性的傳統(tǒng)植物正成為功能性食品開發(fā)的原料來源，研究、提取與應(yīng)用其中的功能性成分，開發(fā)新的功能性產(chǎn)品已成為國(guó)內(nèi)外食品研究矚目的熱點(diǎn)[3-4]。

紅豆杉為紅豆杉科屬種植物，被公認(rèn)為天然珍稀的抗癌植物，其醫(yī)療保健、免疫調(diào)控、代謝調(diào)節(jié)、抗氧化作用等在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中已有大量研究。紫杉醇是紅豆杉屬植物中具有特殊的抗癌作用的次生代謝產(chǎn)物[5-6]，最早由M.C.Wani等[7]從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的樹皮中分離得到并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。常明進(jìn)等[8]發(fā)現(xiàn)從短葉紅豆杉中提取的紫杉醇的含量?jī)H有0.069%，資源及其匱乏。C.L.Manthey等[9]的研究表明紫杉醇除有抗有絲分裂的作用外，尚有激活巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤作用。謝寶芬等[10]報(bào)道紅豆杉中含有的紫杉醇可使動(dòng)物體內(nèi)的免疫功能得到提升，對(duì)動(dòng)物性疾病達(dá)到防御性作用。李循等[11]通過研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅豆杉可以增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫細(xì)胞功能，提高荷瘤小鼠的免疫力和抗菌抗疾病的能力。然而，紅豆杉作為畜禽飼料原料卻鮮有報(bào)道，紅豆杉中紫杉醇的有效含量、在動(dòng)物體內(nèi)的代謝規(guī)律及其對(duì)畜禽膽固醇、卵磷脂等體內(nèi)代謝影響研究甚少，僅趙燕等[12]發(fā)現(xiàn)在肉雞飼糧中添加3%紅豆杉，紫杉醇可沉積在雞肉中，且肝臟中沉積量最高。本試驗(yàn)擬研究不同水平紅豆杉葉改善雞蛋中營(yíng)養(yǎng)成分的效果以及紫杉醇在雞蛋中的沉積水平，研究開發(fā)蛋雞功能性飼料，生產(chǎn)合理營(yíng)養(yǎng)和保健功效的功能性食品。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅豆杉葉：試驗(yàn)選用紅豆杉葉為上一年自紅豆杉樹修剪下的枝葉，自然光照曬干后粉粹而成，紫杉醇含量為19.6 μg/g，由浙江武義曼地亞紅豆杉開發(fā)研究有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取140日齡，體重相近且健康狀況良好的仙居雞400只，隨機(jī)分成4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。其中飼喂基礎(chǔ)飼糧為對(duì)照組，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加2%、3%和4%的紅豆杉葉，記為2%、3%、4%組?；A(chǔ)日糧由浙江省仙居種雞場(chǎng)提供，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)雞只采用雙層立體籠養(yǎng)，雞舍為半封閉式，自然光照和通風(fēng)。預(yù)備試驗(yàn)期7 d，正式試驗(yàn)期90 d。整個(gè)試驗(yàn)期間，雞只自由采食粉狀飼料、自由飲水，試驗(yàn)過程詳細(xì)記錄各組雞的健康情況，按雞場(chǎng)正常免疫程序進(jìn)行免疫和消毒，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件保持一致。

1.3 樣品的收集

試驗(yàn)開始，每間隔10 d隨機(jī)收集對(duì)照組、2%組、3%組、4%組每組每個(gè)重復(fù)組的雞蛋各2枚，放置保存于蛋托中，待測(cè)蛋清、蛋黃中紫杉醇的含量及蛋黃中卵磷脂、膽固醇含量的變化。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 紫杉醇含量的檢測(cè)

參照陳華等[13]方法測(cè)定紫杉醇含量，以克拉霉素為內(nèi)標(biāo)，蛋清、蛋黃勻漿液分別經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，進(jìn)行HPLC-MS法測(cè)定。

1.4.2 蛋清蛋白的分離

參照麻小娟等[14]的方法對(duì)蛋清蛋白進(jìn)行分離。用蛋黃蛋清分離器將蛋黃分離出來，將蛋黃稱重后，稱取2.5 g放入25 mL容量瓶中，加生理鹽水定容至刻度，搖勻，制成蛋黃稀釋液，備用。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Basic diet composition and nutrients

1.4.3 膽固醇含量的檢測(cè)

采用北京北化康泰臨床試劑有限公司所生產(chǎn)的膽固醇試劑盒測(cè)定蛋黃膽固醇含量。樣品前處理方法同1.4.2，取0.1 g/mL的蛋黃稀釋液1 mL于10 mL離心管中，加入 1.0 mL 95%乙醇，用漩渦振蕩器混勻，然后加入2.5 mL乙醚，混勻后再加入2.5 mL石油醚，振蕩混勻，3 000 r/min離心5 min。將上層萃取液移出，在65℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL無水乙醇溶解剩余物。

在測(cè)定膽固醇濃度的基礎(chǔ)上，根據(jù)蛋黃重計(jì)算每枚雞蛋中膽固醇的總含量。

1.4.4 卵磷脂含量的檢測(cè)

采用乙醇提取法對(duì)卵磷脂的含量進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)雞蛋的蛋白和蛋黃進(jìn)行分離，將蛋黃收集燒于杯中備用。稱取一定量的蛋黃于具塞錐形瓶中，按乙醇體積與蛋黃的克數(shù)（mL/g）比例為 10∶1，分別加入不同濃度的乙醇（100%，95%，90%，85%，80%，75%），常溫下在磁力攪拌器上攪拌 1 h，將提取液收集于 50 mL離心管中，4 000 r/min離心 15 min，取上清液，沉淀再加入不同濃度乙醇提取、離心，合并兩次上清液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至近干，取出濃縮物，真空冷凍干燥，得到卵磷脂。稱重，計(jì)算提取率。提取率=（卵磷脂重量/蛋黃重量）×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2007進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0軟件對(duì)整理數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并采用LSD和Duncans檢驗(yàn)法進(jìn)行各組間差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆杉葉添加水平對(duì)紫杉醇在蛋清中沉積量的影響

由表2可見：對(duì)照組蛋清中未檢測(cè)到紫杉醇含量，添加紅豆杉葉后的第10天，3個(gè)試驗(yàn)組蛋清中均未檢測(cè)到紫杉醇含量；第20天可以檢測(cè)到紫杉醇含量，但含量極少，4%組顯著高于2%組（P＜0.05），3%與4%組間差異不顯著（P＞0.05）；第20～70天，2%、3%、4%組間差異顯著（P＜0.05），且 4%組顯著高于2%、3%組（P＜0.05），但2% 與3%組間差異不顯著（P＞0.05）；第80天，3% 與4%組顯著高于2%組（P＜0.05），但 3%與 4%組間差異不顯著（P＞0.05）；第90天，4%組顯著高于2%組，但3%與4%組差異不顯著（P＞0.05），2%與3%組間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 紫杉醇在蛋清中的沉積量的變化Table 2 Changes in the deposition amount of paclitaxel in egg white mg·kg-1

2.2 紅豆杉葉添加水平對(duì)紫杉醇在蛋黃中沉積量的影響

由表3可見：對(duì)照組蛋黃中未檢測(cè)到紫杉醇含量，添加紅豆杉葉后的第10天，2%、3%和4%組蛋黃中均可以檢測(cè)到紫杉醇的含量，但沉積量極少各組間差異不顯著（P＞0.05）；第 20～60天，3組間差異顯著（P＜0.05），4%組顯著高于 2%、3%組（P＜0.05），2%組顯著高于3%組；第70天，3組間差異顯著（P＜0.05），4%組顯著高于其他兩組（P＜0.05），但 2%組與 3%組間差異不顯著（P＞0.05）；第 80天，3%、4%組顯著高于2%組（P＜0.05），但3%與4%組間差異不顯著（P＞0.05）；第 90天，3組間差異顯著（P＜0.05），4%組顯著高于其他兩組（P＜0.05），2%組顯著高于3%組（P＜0.05）。

表3 紫杉醇在蛋黃中的沉積量的變化Table 3 Changes in the deposition of paclitaxel in egg yolk mg·kg-1

2.3 紅豆杉葉添加水平對(duì)仙居雞蛋黃中膽固醇含量的影響

由表4可見：第10天，對(duì)照組、試驗(yàn)組各組間膽固醇含量差異不顯著（P＞0.05），第 20、30、40 天，3個(gè)試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），3個(gè)試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05）；第50天，試驗(yàn)組膽固醇含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），4%組顯著低于其他兩組（P＜0.05），2%、3%組間差異不顯著（P＞0.05）；第 60、70、80、90天，3個(gè)試驗(yàn)組膽固醇顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），3%、4%組顯著低于 2%組（P＜0.05），3%與4%組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 紅豆杉添加水平對(duì)仙居雞蛋黃中卵磷脂含量的影響

由表5可見：第10天，對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組各組間卵磷脂含量差異不顯著（P＞0.05），第 20、30、40天，3個(gè)試驗(yàn)組卵磷脂顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05）；第50天，4%組顯著高于對(duì)照組，對(duì)照組及2%組、3%組組間差異不顯著（P＞0.05），3個(gè)試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05）；第60、70、80天，試驗(yàn)組卵磷脂顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05）；第90天，3%、4%組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），2%與3%組間差異不顯著（P＞0.05），對(duì)照組、2%紅豆杉葉組間差異不顯著（P＞0.05）。

表4 試驗(yàn)雞蛋黃膽固醇含量的變化Table 4 Test the change of cholesterol content in egg yolk mg·kg-1

表5 試驗(yàn)雞蛋黃卵磷脂含量的變化Table 5 Test the change of egg yolk lecithin content mg·kg-1

3 討論與結(jié)論

3.1 紅豆杉葉添加水平對(duì)紫杉醇在蛋清、蛋黃中沉積量的影響

趙燕等[12]發(fā)現(xiàn)將紅豆杉添加到肉雞日糧中，紅豆杉中的紫杉醇可在雞肉中沉積，但沉積量很低。Wang X.等[15]給大白鼠靜脈注射5 mg/kg紫杉醇后，在各組織中進(jìn)行紫杉醇含量檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，紫杉醇在肝臟中含量較高。孟素蕊等[16]通過對(duì)昆明小鼠進(jìn)行尾靜脈注射9 mg/kg紫杉醇注射液，發(fā)現(xiàn)紫杉醇在肝臟分布最多，其次是腎臟。說明紫杉醇不論以任何形式（注射紫杉醇注射液或飼喂紅豆杉飼料）進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，都可以沉積到體內(nèi)各組織，但紫杉醇在雞蛋中的沉積目前尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紅豆杉葉中的紫杉醇可以從飼糧中轉(zhuǎn)移到雞蛋中，且在蛋清和蛋黃中都可以檢測(cè)到紫杉醇的含量，說明雞蛋可以作為紫杉醇的載體，且紫杉醇可以在蛋清、蛋黃中沉積，為開發(fā)富含紫杉醇雞蛋產(chǎn)品提供了依據(jù)。

3.2 紅豆杉葉添加水平對(duì)仙居雞雞蛋蛋黃中膽固醇含量的影響

膽固醇是影響家禽蛋品質(zhì)的重要指標(biāo)，主要存在于家禽蛋黃中，通常將蛋黃中膽固醇的含量作為評(píng)價(jià)蛋品質(zhì)的依據(jù)[17]。雞蛋中膽固醇的含量較高，且在蛋黃中膽固醇含量約10.34 mg/g[18]，為滿足不同人群的需要，低膽固醇雞蛋備受人們關(guān)注[19-23]，有研究表明，高膽固醇會(huì)導(dǎo)致人類高血脂、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病[24]，雞蛋源膽固醇比其他食品源膽固醇更易導(dǎo)致人體血清膽固醇水平的提高，因而有必要對(duì)雞蛋中膽固醇的含量進(jìn)行分析[25]；美國(guó)心臟病研究會(huì)推薦人體每天膽固醇攝入量不應(yīng)超過300 mg，可減少高脂血癥和冠心病的危險(xiǎn)[26]。因此，探索減少雞蛋中膽固醇的含量已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在仙居雞飼糧中添加紅豆杉葉可降低蛋黃中膽固醇的含量，隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)、添加水平的增加，膽固醇含量下降的趨勢(shì)越明顯，說明紅豆杉葉產(chǎn)生作用需要一定的時(shí)間。紅豆杉中含有的主要成分除紫杉烷類，還有黃酮類物質(zhì)、紅豆杉多糖類物質(zhì)等也兼具有消炎殺菌等作用[27]。徐國(guó)銀[28]在蛋雞飼糧中添加大豆黃酮，結(jié)果表明大豆黃酮使蛋黃膽固醇含量顯著降低，并且時(shí)間越久作用效果越明顯。尹靖東等[29]試驗(yàn)表明日糧中添加10 mg/kg大豆黃酮有降低產(chǎn)蛋雞血漿總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的作用；蛋黃膽固醇濃度隨大豆黃酮添加量升高而顯著降低，且隨著添加量升高，雞蛋膽固醇含量出現(xiàn)遞減趨勢(shì)。在飼糧中添加紅豆杉葉能夠降低蛋黃中膽固醇的含量，可能因?yàn)榧t豆杉中含有的黃酮類和生物堿性物質(zhì)可以和膽固醇部分結(jié)合，減少了膽固醇向蛋黃中的轉(zhuǎn)移[30]。對(duì)于紅豆杉作用的最佳時(shí)長(zhǎng)及是否可以通過增加添加水平來縮短起效時(shí)間尚需進(jìn)一步研究。

3.3 紅豆杉葉添加水平對(duì)仙居雞蛋黃中卵磷脂含量的影響

卵磷脂是動(dòng)植物體內(nèi)一種非常重要的含磷物質(zhì)，主要包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸等成分[31]。卵磷脂是人體細(xì)胞生物膜的重要組成部分和脂質(zhì)來源，而在雞蛋蛋黃中卵磷脂含量占其總量的2%～6%[32]。研究表明，卵磷脂具有良好的生理特性，如抗氧化活性[33]；提高大腦的活性和加強(qiáng)記憶力[34]；降低血脂，減少脂質(zhì)在血管內(nèi)壁的停留時(shí)間，降低膽固醇[35]等。卵磷脂在食品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域都有應(yīng)用[36-37]。天然卵磷脂廣泛存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，以蛋黃、大豆內(nèi)含量較多，其中蛋黃卵磷脂具有含量高、易吸收、氧化穩(wěn)定性好的顯著優(yōu)勢(shì)，因此蛋黃卵磷脂的功能特性及應(yīng)用開發(fā)日益受到人們的關(guān)注[38]。在仙居雞基礎(chǔ)日糧中添加紅豆杉葉后，蛋黃中卵磷脂的含量明顯得到了改善。這可能與紅豆杉中含有的黃酮類物質(zhì)有關(guān)，張琳等[39]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物可以提高蛋黃卵磷脂的含量。但目前將紅豆杉葉應(yīng)用于蛋雞生產(chǎn)的報(bào)道幾乎沒有，具體紅豆杉中什么物質(zhì)的含量對(duì)卵磷脂起到改善作用，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加4%的紅豆杉葉，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提高了雞蛋蛋黃中卵磷脂的含量。因此，在蛋雞飼糧中添加紅豆杉葉對(duì)蛋雞生產(chǎn)有著重要的意義，有待于開發(fā)利用。

綜上，在仙居雞飼糧中添加紅豆杉葉后，紫杉醇可以沉積到蛋清和蛋黃中，且可提高蛋黃卵磷脂的含量、同時(shí)降低膽固醇的含量，以4%的紅豆杉葉的添加水平效果最佳。