張 璐， 王照地， 劉 璐， 王世革， 黃明賢

（上海理工大學(xué) 理學(xué)院，上海 200093）

高效液相色譜在食品、醫(yī)藥、生命及環(huán)境等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。硅膠基質(zhì)以其機(jī)械強(qiáng)度高、粒徑分布均勻、孔構(gòu)造和比表面積易于控制、表面易改性、有機(jī)溶劑中不溶脹等優(yōu)勢，成為最常用的高效液相色譜填料[1-5]。近年來，硅膠整體柱由于其高通透性和快速分析的特點，在色譜研究領(lǐng)域受到日益廣泛重視[6-15]。

在近期的研究中，硅膠整體柱主要是在毛細(xì)管柱內(nèi)形成，由于柱子內(nèi)徑小，所能承受的柱流量很小，不適用于一般色譜儀器和色譜分析。但硅膠整體柱的制備方法已有大量的研究和報道，有很多可以借鑒的地方。將硅膠整體柱進(jìn)行研磨和篩分，可以用來制備適合于當(dāng)今常用的高效液相色譜分析的色譜柱填料[16-18]，并且保存了微孔結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)和通透性高的優(yōu)異特性。

本研究以聚乙二醇（PEG）為致孔劑，以四甲氧基硅烷（TMOS）為硅源，使其在醋酸和尿素的催化作用下水解縮合，從而形成硅膠整體柱；將此整體柱研磨后，再進(jìn)行煅燒和浮選得到合適粒徑的硅膠顆粒；最后通過表面修飾制備一系列新型色譜固定相。反相色譜是最常用的色譜模式，因此，本研究探索3 種新型反相色譜固定相的制備方法。另外，限進(jìn)型色譜固定相在血液中的藥物分析方面發(fā)揮著巨大作用[19-24]，本研究也探討了一種新型限進(jìn)介質(zhì)色譜固定相的制備方法。通過對所制備的新型色譜固定相進(jìn)行色譜測試和應(yīng)用評價，考察了基于硅膠整體柱的研磨與表面修飾方法制備高效液相色譜固定相的潛力。

1 實 驗

1.1 材料與設(shè)備

四甲氧基硅烷（TMOS，純度大于99%）、聚乙二醇（PEG，聚合度為10 000，分析純）、硬脂酸乙烯酯（優(yōu)級純）、甲醇（HPLC 級）、四氫呋喃（THF，優(yōu)級純）和正十八硫醇（97%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。過氧化苯甲酰（BPO，優(yōu)級純）購自北京百靈威科技公司。尿素、冰醋酸、二氧六環(huán)、無水甲苯、咪唑、乙酸乙酯、乙腈、乙醇、偶氮二異丁腈（AIBN）、γ-（2，3-環(huán)氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（KH-560）、三乙胺、乙酸酐、四丁基氟化銨（以上均為優(yōu)級純）和乙腈（HPLC 級）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。7-辛烯基二甲基氯硅烷購自美國Gelest 公司。mPEG1000-SH（聚合度為1 000）和mPEG2000-SH（聚合度為2 000）購自上海梵碩生物科技公司。色譜應(yīng)用測試樣品如塑化劑、標(biāo)準(zhǔn)藥物以及牛血清蛋白（BSA）等購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

使用的儀器設(shè)備包括：230II 系列高效液相色譜儀和EC2006 色譜數(shù)據(jù)處理工作站（大連依利特分析儀器有限公司），150 mm×4.6 mm 色譜柱管和液相色譜裝柱機(jī)（深圳正大流體機(jī)電設(shè)備有限公司）；Tristar II 3020 比表面與孔徑分析儀（美國Micromeritics 公司）；VEGA3 掃描電子顯微鏡（SEM）（泰思肯貿(mào)易上海有限公司），SKL 箱式高溫?zé)Y(jié)爐（合肥晶科材料技術(shù)有限公司），KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱和真空干燥箱（上?！憧茖W(xué)儀器有限公司），高速臺式離心機(jī)（德國NUAIRE 公司），行星式球型研磨機(jī)（長沙科德儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 硅膠顆粒的合成

取4.86 g 聚乙二醇（PEG，聚合度為10 000）和4.95 g 尿素于聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)襯中，用45 ml摩爾濃度為0.01 mol/l 的乙酸溶液溶解并進(jìn)行磁力攪拌。10 min 后，加入5 ml 四甲氧基硅烷（TMOS），再繼續(xù)攪拌40 min。將盛有混合透明溶液的內(nèi)襯置于水熱反應(yīng)釜中，并在40 ℃的烘箱中溫育48 h，之后再將烘箱調(diào)至120 ℃繼續(xù)溫育48 h。反應(yīng)完畢降至室溫后，得到白色固體產(chǎn)物。將此產(chǎn)物依次用水浸泡2 次，乙醇浸泡1 次，去掉液體后，將整塊固體在80 ℃條件下干燥過夜，然后將此固體用研缽搗碎，再用球研磨機(jī)研磨（轉(zhuǎn)速為150 r/min） 60 min，最后在550 ℃煅燒5 h。將煅燒后的硅膠顆粒在室溫下分散于無水乙醇中，超聲處理30 min，然后使懸浮液自然沉降，3 h 后去掉未完全沉降的上層，剩下的固體烘干保存。

1.2.2 含烯鍵C8 鍵合固定相

將煅燒和浮選好的硅膠顆粒置于70 ℃的鼓風(fēng)干燥箱干燥48 h。取烘干后的硅膠顆粒5.61 g，通過干燥潔凈的漏斗加入到250 ml 的三頸圓底燒瓶中，再加入150 ml 無水甲苯，接上攪拌器，調(diào)轉(zhuǎn)速260 r/min，同時連接氮氣，油浴升溫至110 ℃攪拌并甲苯回流30 min 除水，之后加入3.6 g 咪唑。取3.6 ml 7-辛烯基二甲基氯硅烷加入上述混合溶液中，繼續(xù)在通氮氣環(huán)境下110 ℃回流并攪拌12 h。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，過濾除去清液，用適量無水甲苯洗滌固體顆粒，再依次用甲醇、甲醇/水（50/50，體積比）混合溶劑、和甲醇離心洗滌。最后在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)70 ℃干燥6 h，得到含烯鍵的C8 鍵合固定相。

1.2.3 巰基-烯點擊反應(yīng)制備反相色譜固定相

取3.5 g 含烯鍵C8 鍵合的硅膠顆粒，通過干燥的漏斗加入到三頸圓底燒瓶底部，加入150 ml二氧六環(huán)，之后通氮氣，溫度調(diào)至70 ℃，加入1.36 g正十八硫醇和0.068 g 偶氮二異丁腈（AIBN），繼續(xù)在70 ℃攪拌反應(yīng)8 h。然后依次用二氧六環(huán)、甲醇離心洗滌2 次。所得產(chǎn)品置于70 ℃烘箱中干燥3 h，在60 ℃下真空干燥3 h。

1.2.4 硬脂酸乙烯酯表面聚合固定相

取適量堿性氧化鋁分散在適量乙酸乙酯溶劑中，之后稱量3 g 硬脂酸乙烯酯（Vinyl Stearate）溶于其中。將上述鍵合的含烯鍵C8 的硅膠放入250 ml三頸圓底燒瓶中，加入150 ml 乙酸乙酯，置燒瓶于油浴加熱鍋，攪拌速度為230 r/min，將上述硬脂酸乙烯酯單體溶液過濾到燒瓶中，隨后用N2保護(hù)，加熱油浴鍋溫度至65 ℃。待溫度穩(wěn)定，加入100 mg 引發(fā)劑BPO（過氧化苯甲酰），繼續(xù)加熱攪拌反應(yīng)12 h。將得到的硬脂酸乙烯酯表面聚合固定相依次用乙酸乙酯和甲醇各洗2 遍。70 ℃烘箱中干燥3 h 后在60 ℃下真空干燥3 h。

1.2.5 限進(jìn)介質(zhì)色譜固定相的制備

取6 g 前期制備的硅膠顆粒加入到250 ml 三頸圓底燒瓶中，以200 ml 甲苯為溶劑，油浴鍋加熱至70 ℃并進(jìn)行攪拌（速度為230 r/min），再加入10 ml的硅烷偶聯(lián)劑γ-（2，3-環(huán)氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（KH560），70 ℃攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)完成后，分別用甲苯、乙醇、乙醇/水和乙醇離心洗滌固體顆粒各1 次，得到帶有環(huán)氧基的硅膠基質(zhì)，鼓風(fēng)干燥箱70 ℃烘干過夜備用。

取γ-（2，3-環(huán)氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷鍵合的硅膠顆粒5 g，與200 ml 四氫呋喃一起加入到250 ml 三頸圓底燒瓶中，再加入2 g mPEG1000-SH 和1 g mPEG2000-SH，待固體全部溶解后，加入5 ml 的四丁基氟化銨溶液（1 mol/l THF 作溶劑），反應(yīng)液在30 ℃攪拌3 h 后，將反應(yīng)物用離心機(jī)離心分離，用乙醇洗滌3 次，在70 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥6 h。

將上述反應(yīng)產(chǎn)物分散于50 ml THF 中，加入3 ml乙酸酐和1 ml 三乙胺，在30 ℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)3 h。分別用乙醇洗2 次，乙醇/水洗1 次，乙醇洗1 次離心洗滌，70 ℃鼓風(fēng)干燥箱干燥9 h 得到一種限進(jìn)介質(zhì)色譜固定相。

1.2.6 裝柱及測試

制備配比為1∶1 的異丙醇和三氯甲烷的混合液，以此為裝柱勻漿液。取鍵合好的硅膠固定相2 g，加入上述勻漿液50 ml，超聲2 min，然后在34.48 MPa 的壓力下用甲醇通過裝柱機(jī)將填料裝入內(nèi)徑4.6 mm、長150 mm 的色譜柱中。

1.2.7 色譜測試

以尿嘧啶、苯乙酮、甲苯、乙苯、萘和芴等標(biāo)準(zhǔn)化合物為樣品對裝好的色譜柱進(jìn)行反相色譜測試：流動相為甲醇和水；UV 檢測波長為254 nm。用塑化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或?qū)?biāo)準(zhǔn)藥品分散在牛血清蛋白（BSA）中作為應(yīng)用測試樣品，色譜條件列于相應(yīng)的色譜圖說明中。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅膠基質(zhì)顆粒的制備

硅膠整體柱的制備可以借鑒很多毛細(xì)管內(nèi)硅膠整體柱的制備方法[6-15]，其中，整體柱的制備條件決定了硅膠骨架的結(jié)構(gòu)，從而決定了研磨后硅膠顆粒的大小和形貌。根據(jù)毛細(xì)管內(nèi)硅膠整體柱制備方面的文獻(xiàn)和前期的實驗摸索，采用以聚乙二醇為致孔劑，四甲氧基硅烷為硅源，在醋酸和尿素的催化作用下水解縮合的方法來制備硅膠整體柱。將此整體柱研磨后，再進(jìn)行煅燒和浮選，得到合適粒徑的硅膠顆粒。研究發(fā)現(xiàn)，在控制反應(yīng)時間在48 h、反應(yīng)溫度為先40 ℃然后升溫至120 ℃、研磨速度為150 r/min、研磨時間為1 h 等條件下，可以得到如圖1 所示的硅膠顆粒。從圖1（a）中可以看出，硅膠顆粒保留了硅膠整體柱的骨架部分，粒徑在4～6 μm 之間，并且從圖1（b）中可以清楚地觀察到硅膠顆粒的粗糙多孔表面結(jié)構(gòu)。這種硅膠顆?；緷M足了色譜用硅膠基質(zhì)的均勻粒徑（5 μm 左右）和多孔性結(jié)構(gòu)的要求。

圖1 硅膠顆粒的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像Fig.1 Scanning electron microscope（SEM）images of silica particles

2.2 反相色譜固定相的制備

反相色譜是高效液相色譜中最常用的色譜模式，一般以C18 鍵合固定相為主，本研究試圖制備3 種新型反相色譜固定相。首先，以甲苯為反應(yīng)分散劑，咪唑為催化劑，通過7-辛烯基二甲基氯硅烷與硅膠的表面硅羥基之間的鍵合反應(yīng)制備含雙鍵的C8 鍵合固定相。咪唑是一種弱堿性化合物，可以中和反應(yīng)過程中生成的鹽酸。7-辛烯基二甲基氟硅烷（C8）通過穩(wěn)定的Si—O—Si—C 鍵合到硅膠表面，如圖2 所示。

圖2 含雙鍵C8 固定相制備示意圖Fig.2 Schematic diagram of the preparation of vinyl group containing C8 stationary phase

巰基-烯點擊反應(yīng)是常用的表面修飾和嫁接的方法[25-26]，這種方法可以使材料表面改性，也可用來制備色譜固定相。本研究中通過硫醇-烯點擊反應(yīng)在上述制備的含雙鍵的C8 鍵合固定相上進(jìn)一步鏈接正十八硫醇，期望以此增加硅膠表面的疏水性，反應(yīng)示意圖如圖3 所示。

圖3 通過硫醇-烯點擊反應(yīng)制備反相色譜固定相示意圖Fig.3 Schematic diagram of the preparation of stationary phase via thiol-ene click reaction

另外，聚合物鍵合和涂覆的硅膠固定相也得到廣泛的使用[27-28]，這種表面修飾方法可以進(jìn)一步增加硅膠固定相的選擇性。本研究中將硬脂酸乙烯酯通過自由基共聚合反應(yīng)接枝到前期制備的含雙鍵C8 鍵合的硅膠表面，反應(yīng)過程如圖4所示。

圖4 硬脂酸乙烯酯聚合固定相制備流程示意圖Fig.4 Schematic diagram of the preparation of vinyl stearate polymerization stationary phase

在圖4 的反應(yīng)中，過氧化苯甲酰作為自由基聚合引發(fā)劑，硬脂酸乙烯酯作為聚合反應(yīng)單體，與硅膠表面鍵合的7-辛烯基中的雙鍵發(fā)生自由共聚合反應(yīng)，形成硬脂酸乙烯酯聚合物固定相。由于每一個表面雙鍵都有可能嫁接上n（n＞1）個硬脂酸乙烯酯單體，這種接枝聚合方法能進(jìn)一步增加硅膠表面的疏水性能，從而增加其反相色譜保留和分離選擇性。

2.3 反相色譜固定相的測試

將上述3 種色譜固定相的反相色譜行為進(jìn)行測試和對比。在相同的洗脫條件下，相比于C8鍵合固定相（圖5（a）），通過硫醇-烯點擊反應(yīng)鏈接的正十八硫醇固定相顯示了增強(qiáng)的色譜保留（圖5（b））；而硬脂酸乙烯酯修飾的固定相對分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間更長且分離效果更好（圖5（c））。這些色譜分離結(jié)果間接證明了硅膠表面發(fā)生了本文所設(shè)計的表面修飾化學(xué)反應(yīng)。同時，這3 種色譜柱的柱前壓都比一般球型5 μm 硅膠色譜柱的柱前壓要小，證明了這種硅膠基質(zhì)通透性好的優(yōu)點。

圖5 反相色譜測試比較Fig. 5 Comparison of reversed phase chromatograms

考察了新制備的反相色譜固定相對標(biāo)準(zhǔn)塑化劑化合物的色譜分離效果，結(jié)果如圖6 所示。在梯度洗脫條件下，可以看出3 種常見的塑化劑化合物都得到了非常高效的分離。塑化劑為一類對人體有害的化合物，在某些飲料和酒中曾發(fā)現(xiàn)了少量塑化劑。本研究所制備的色譜填料可以為塑化劑的色譜分析提供幫助。

圖6 反相固定相用于塑化劑的應(yīng)用測試Fig. 6 Separation of common plasticizers with reverse stationary phase

在色譜基質(zhì)的性能測試中，范德姆特（Van Deemter）曲線可以很好地反映出硅膠顆粒的特征及性能。圖7 為測得的Van Deemter 曲線，從圖中可以看出，隨著流速的增加，乙苯的塔板高度先減小后增加，最后趨于平緩，在0.4 ml/min 時達(dá)到最?。ㄋ甯叨仍叫?，塔板數(shù)越大，柱效越好）。這種硅膠材料由于其特殊的形狀，在高流速狀態(tài)下，塔板高度變化不大，并沒有明顯增加的趨勢，因此，可以進(jìn)行快速的HPLC（高效液相色譜）分析，體現(xiàn)了此種硅膠顆粒之高通透性的優(yōu)勢。

圖7 乙苯在C8 反相色譜柱上的范德姆特曲線Fig.7 Van Deemter curve of ethylbenzene on C8 stationary phase

2.4 限進(jìn)介質(zhì)色譜固定相的制備和測試

將硅膠整體柱研磨、煅燒和浮選得到的硅膠顆粒，首先與KH560 發(fā)生鍵合反應(yīng)，再與含巰基的PEG 分子通過巰基-環(huán)氧反應(yīng)在硅膠表面鏈接PEG[29-30]，最后，用乙酸酐與硅膠表面的羥基反應(yīng)生成乙酸酯，從而得到一種新型限進(jìn)介質(zhì)色譜固定相。圖8 是反應(yīng)流程示意圖。

這種限進(jìn)介質(zhì)色譜固定相的特點是最外層的長鏈親水PEG 分子阻礙了蛋白質(zhì)大分子與其內(nèi)層疏水基團(tuán)的作用，即達(dá)到蛋白質(zhì)限進(jìn)的作用，所以稱為限進(jìn)介質(zhì)。但是，一般藥物小分子可以滲透到內(nèi)層，有一定的反相色譜保留。首先對新制備的限進(jìn)介質(zhì)固定相進(jìn)行了反相測試，色譜測試條件中，流速為0.8 ml/min，流動相為甲醇/水（體積比為40/60），紫外檢測波長為254 nm。其中，色譜峰鑒定分別有：a. 尿嘧啶，b. 乙苯，c. 萘。結(jié)果顯示，這種色譜柱疏水性不強(qiáng)，只有當(dāng)水在移動相的比例較高時，才有一定的色譜保留，結(jié)果如圖9 所示。對于限進(jìn)性固定相，移動相一般含水量大，所以，新制備的限進(jìn)介質(zhì)固定相符合相應(yīng)的色譜分析要求。

圖8 限進(jìn)介質(zhì)固定相制備流程示意圖Fig.8 Schematic diagram of the preparation of restricted access media stationary phase

圖9 限進(jìn)介質(zhì)固定相的反相色譜測試Fig. 9 Restricted access media stationary phase reverse phase test

限進(jìn)介質(zhì)色譜固定相在藥物代謝分析中得到了廣泛應(yīng)用[19-24]。一般要求是將血液中的藥物過濾后直接進(jìn)入色譜柱進(jìn)行色譜分析，血清中的大量蛋白一般以不保留的方式首先流出，被分析藥物會滲透到固定相的內(nèi)部，并在色譜柱上通過反相色譜作用進(jìn)行分離。本研究所選的2 種藥物分別為酮洛芬和依托度酸，其分子結(jié)構(gòu)如圖10 所示。

將上面2 種藥物分散在牛血清蛋白BSA 中，直接進(jìn)樣分析，得到的色譜圖如圖11 所示?？梢钥闯觯谒苽涞南捱M(jìn)介質(zhì)色譜固定相上，以流動相為PBS（pH 3.5）/ACN（80/20, 體積比），流速為0.8 ml/min，紫外波長220 nm 的檢測條件下。BSA 無保留地流出，而2 種藥物得到了較好的保留和分離，與前述的限進(jìn)介質(zhì)分離原理一致，可實現(xiàn)這些藥物在血清中的定性定量分析。

圖10 酮洛芬和依托度酸的分子結(jié)構(gòu)Fig. 10 Strucutres of ketoprofen and etodolac

圖11 限進(jìn)介質(zhì)固定相HPLC 分離BSA 中的酮洛芬和依托度酸Fig. 11 HPLC for the separation of ketoprofen and etodolac drugs in BSA on the restricted access media stationary phase.

作者還進(jìn)一步測試了本研究所制備的硅膠鍵合前后的比表面積、孔體積和孔徑的變化，結(jié)果列在表1 中。由表1 可以看出，鍵合前硅膠顆粒的孔徑在16 nm 左右，鍵合后比表面積和孔徑都有所減少，說明硅膠孔表面形成了一薄層鍵合物質(zhì)。

表1 硅膠基質(zhì)及KH-560 鍵合硅膠的BET 和BJH 測試數(shù)據(jù)Tab.1 BET and BJH measurement data of the as-prepared silica and KH-560 bonded silica

3 結(jié) 論

通過整體柱制備、研磨、煅燒和浮選，得到不定型的介孔硅膠顆粒，顆粒大小在4～6 μm，孔徑約為16 nm，適合用作當(dāng)今一般高壓液相色譜的填料。采用本文的方法制備硅膠基質(zhì)，方法簡便、成本低、性能好。另外，通過不同表面修飾方法，可以利用本研究得到的硅膠制備出一系列高效液相色譜固定相。這些新型固定相都顯示出較好的色譜分離效果，并且在塑化劑的分析和血樣中藥物的分析方面顯示出一定的應(yīng)用潛力。

可以預(yù)計，本研究制備的不定型的介孔硅膠基質(zhì)，通過其他不同化學(xué)鍵合手段或涂覆法表面修飾后，可滿足不同的色譜分離分析的要求。隨著色譜技術(shù)在生物、醫(yī)藥及環(huán)境等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，新型色譜固定相的研究將發(fā)揮巨大作用。