雷雅婷張也羅堃王元清蔣波5嚴(yán)建業(yè)

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；3. 湖南省永州市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 永州 425000；4. 中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)與工程實驗室，湖南 長沙 410004；5. 湖南省藥品審評認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測中心，湖南 長沙 410013)

蘆筍為禾本科蘆葦屬(PhragmitesAdans.)植物蘆葦(P.communisTrin.)的嫩芽，具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值，被譽為“洞庭蟲草”。研究表明[1-2 ]，蘆葦植物的蘆根、蘆葉、蘆花、蘆莖、蘆筍等含有豐富的化學(xué)成分，包括黃酮類、酚酸類、多糖類等，其中黃酮類成分為蘆葦?shù)闹饕煞?。目前，蘆根與蘆葉等相關(guān)研究報道較多[3-4]，特別是百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物的地上莖也稱之為“蘆筍”，它的研究報道也比較豐富[5]，而對于禾本科蘆筍的研究報道零星可見。大孔吸附樹脂是一類內(nèi)部具有較大間隙結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，大量的微觀顆粒組成宏觀的球狀顆粒，并且在微觀顆粒之間存在間隙，所以大孔樹脂可以大量吸附分離有機物，并且廣泛應(yīng)用于食材藥材的活性成分分分離純化研究[6]。本文將研究禾本科蘆筍中總黃酮在大孔吸附樹脂上靜態(tài)與動態(tài)吸附性能，優(yōu)選蘆筍總黃酮純化工藝，為禾本科蘆筍食品產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(寶雞市辰光生物科技有限公司)；氫氧化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；亞硝酸鈉(湖南匯虹試劑有限公司)，硝酸鋁(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(株洲石英化玻有限公司)，95%乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)均為分析純；蒸餾水(中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實驗室)。

1.2 實驗材料 蘆筍采于湖南沅江；D101大孔樹脂、AB-8大孔樹脂與HPD100大孔樹脂(購于東鴻化工有限公司)。

1.3 實驗儀器 SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；光照恒溫(恒濕)搖床(上海天呈實驗儀器制造有限公司)；YRE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；DK-2000-Ⅲ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；UV-5500型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；202-OA型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 D101大孔吸附樹脂的預(yù)處理 參照文獻(xiàn)方法[7]，對D101大孔樹脂進(jìn)行95%乙醇洗、蒸餾水洗、5%鹽酸洗、蒸餾水洗、2%氫氧化鈉洗、蒸餾水洗等過程去掉樹脂中的雜質(zhì)，抽濾，置于冰箱冷藏，備用。

1.4.2 蘆筍的預(yù)處理 稱取曬干后的蘆筍150 g置于2000 ml的燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇提取3次，加乙醇量分別為1500 ml、1200 ml、1200 ml，水浴加熱回流提取時間分別為1.5 h、1.0 h、1.0 h，合并濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至體積為濃度為1∶0.5(約300 ml)的樣品溶液，存放在冰箱冷凍室，備用。

1.4.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.50 mg置于25 ml的容量瓶中，80%乙醇溶液溶解，定容后搖勻。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，均置于10 ml的容量瓶中，加入0.3 ml 5%亞硝酸鈉，搖勻后靜置6 min，再加入0.3 ml 10%硝酸鋁，搖勻后靜置6 min，加入4 ml 4%氫氧化鈉溶液，蒸餾水定容，搖勻后靜置15 min，在510 nm處分別測量吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x)和吸光值(y)進(jìn)行擬合回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=12.524x-0.0043，R2=0.9987。

1.4.4 樣品中總黃酮的測定 取適量樣品溶液，照1.4.3的方法進(jìn)行顯色，測定吸光值，計算樣品中總黃酮的含量。

1.4.5 靜態(tài)吸附性能的考察

1.4.5.1 三種大孔吸附樹脂對蘆筍總黃酮的靜態(tài)吸附率 分別精確稱量預(yù)處理之后的D101、AB-8、HPD100大孔樹脂各1.00 g分別置于三個容量為100 ml的三角瓶中，精確加入樣品溶液(濃度為1∶0.5)10 ml，置于25℃恒溫條件下，在110 r/min的搖床中振蕩吸附24 h，吸取上清液，測定總黃酮的含量，蘆筍總黃酮在D101、AB-8、HPD100三種大孔吸附樹脂上的吸附率。

1.4.5.2 三種大孔吸附樹脂對蘆筍總黃酮的靜態(tài)解吸率 將吸附飽和的D101、AB-8、HPD100大孔樹脂均用50 ml蒸餾水淋洗，將25 ml體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液加入飽和樹脂中，置于25℃恒溫條件下，以110 r/min的搖床中振蕩吸附24 h，吸取上清液，測定總黃酮的含量、蘆筍總黃酮在D101、AB-8、HPD100大孔吸附樹脂上的解吸率。

1.4.5.3 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線 精確稱量處理之后的D101、AB-8、HPD100大孔樹脂各1.00 g，分別置于容量為100 ml的三個錐形瓶中，精確加入樣品溶液20 ml，置于25℃恒溫條件下，在110 r/min的搖床中振蕩并計時，在0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h時取適量上清液測定總黃酮的含量，繪制蘆筍總黃酮在D101、AB-8、HPD100大孔吸附樹脂上的靜態(tài)吸附曲線。

1.4.6 動態(tài)吸附性能的考察

1.4.6.1 動態(tài)吸附徑高比的選擇 精確稱量等量的D101大孔吸附樹脂三份，分別采用濕法裝柱于3根內(nèi)徑不同的樹脂柱中，使其徑高比分別為1∶3、1∶4、1∶5，量取3份質(zhì)量濃度為1∶0.25的樣品溶液上樣于3根樹脂柱，上樣量為2樹脂裝柱體積(BV)，靜置4 h。調(diào)節(jié)開關(guān)，使樣品溶液以1 BV每小時的流速經(jīng)過D101大孔樹脂柱，用4 BV水洗，合并過柱樣品液與水洗液，定容至100 ml，測定總黃酮的含量，選出最佳的徑高比。

1.4.6.2 動態(tài)吸附泄露曲線的測定 精確稱量一定的D101大孔吸附樹脂，濕法裝柱，使樹脂柱的徑高比為1∶5，量取2 BV質(zhì)量濃度為1∶0.25的樣品溶液上樣于樹脂柱中，靜置4 h，調(diào)節(jié)開關(guān)，使樣品溶液以1 BV/h的速度流過大孔樹脂柱，每4 ml泄露液裝于離心管中，測定黃酮含量，繪制泄露曲線。

1.4.6.3 動態(tài)吸附洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的確定 將裝柱后的樹脂柱先用5 BV蒸餾水洗，先后用體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液各50 ml洗脫，將各洗脫液測定總黃酮含量，計算黃酮洗脫率。

1.4.6.4 動態(tài)吸附水洗體積的確定 精確稱量一定的D101大孔吸附樹脂，濕法裝柱，使樹脂柱的徑高比為1∶5，量取2 BV質(zhì)量濃度為1∶0.25的樣品溶液上樣于樹脂柱中，靜置4 h，調(diào)節(jié)開關(guān)，使樣品溶液以1 BV/h的速度流過大孔樹脂柱，反復(fù)上樣3次，再用蒸餾水洗，分段收集水洗液，每段收集1 BV。實驗觀察每段水洗液的Molish反應(yīng)，確定最佳水洗體積。

1.4.6.5 動態(tài)吸附洗脫曲線 將1.4.6.4中的樹脂柱用90%乙醇洗脫至樹脂柱無色，將每10 ml洗脫液裝于離心管中，測定洗脫液中的總黃酮含量，繪制洗脫曲線。

1.4.6.6 蘆筍總黃酮純度的驗證 濃度為1∶0.25(水與樣品的體積比)的樣品5 BV上樣于徑高比1∶5的D101大孔樹脂柱，靜置4 h，7 BV水洗，60 ml 90%乙醇洗脫，重復(fù)3次，測定洗脫液中總黃酮的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解吸率的測定結(jié)果 考察蘆筍樣品溶液中總黃酮在三種不同型號大孔樹脂上的靜態(tài)吸附量與解吸率，結(jié)果見圖1。蘆筍樣品溶液中總黃酮在不同型號大孔樹脂上的靜態(tài)吸附量與解吸率存在差異，其靜態(tài)吸附量大小關(guān)系為AB-8>D101>HPD100，采95%乙醇解吸附時解吸率大小順序為HPD100>AB-8>D101。

2.2 靜態(tài)吸附動力曲線 D101、AB-8、HPD100三種大孔樹脂吸附蘆筍樣品溶液24 h，其總黃酮的靜態(tài)吸附動力曲線如圖2。蘆筍總黃酮在各大孔吸附樹脂上吸附較快，吸附前期吸附速度較快，當(dāng)吸附時間在4 h左右時達(dá)到靜態(tài)吸附平衡。綜合三種樹脂對蘆筍總黃酮的靜態(tài)性能分析，選擇D101大孔吸附樹脂進(jìn)行動態(tài)性能考察。

2.3 動態(tài)吸附徑高比考察 將樣品溶液上樣于不同徑高比的D101大孔樹脂柱中，測定每克樹脂的總黃酮泄漏量，結(jié)果見圖3。在測試的三個比例中，徑高比為1∶5時，D101大孔吸附樹脂的泄漏量最低，說明徑高比為1∶5時蘆筍總黃酮的吸附率最高。再綜合考慮到吸附率和使用樹脂的利用率，選用徑高比為1∶5時對蘆筍中總黃酮進(jìn)行吸附分離。

2.4 動態(tài)吸附泄露曲線 將樣品溶液上樣于D101大孔樹脂柱中，每4 ml一份，測定每份流出液中的總黃酮含量，泄漏量與流出液的的動態(tài)吸附泄露曲線見圖4，蘆筍總黃酮動態(tài)泄漏量-流出液體積的數(shù)學(xué)方程擬合情況見表1。由圖4可知，樣品從第8份開始有不同程度的泄露；由表1可知，總黃酮動態(tài)泄漏量-流出液的第7～11份數(shù)學(xué)方程模擬為：y=3.227x-21.044，線性關(guān)系較好，P值為0.007<0.05，表明模擬的數(shù)學(xué)方程具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 D101大孔樹脂總黃酮動態(tài)泄漏量-流出液體積數(shù)學(xué)方程

2.5 動態(tài)吸附洗脫劑的體積分?jǐn)?shù) 將吸附飽和的D101大孔樹脂水洗后用不同濃度的乙醇洗脫，測定洗脫液中的總黃酮含量，結(jié)果如圖5?？傸S酮在不同濃度的乙醇中都有洗脫，主要集中在50%乙醇洗脫液中，其洗脫量的關(guān)系大小為：50%乙醇 > 30%乙醇 > 70%乙醇 > 10%乙醇 >90%乙醇，特別是在90%的乙醇溶液中有部分總黃酮，因而可以采用90%乙醇洗脫總黃酮，可將其洗脫完全。

2.6 動態(tài)吸附水洗體積的確定 將5 BV樣品溶液上樣于D101大孔吸附樹脂，反復(fù)3次，用不同倍量的水洗脫，molish反應(yīng)判斷終點，結(jié)果見表2。使用6 BV水洗后的水洗液molish反應(yīng)仍然為陽性，而使用7 BV水洗后molish反應(yīng)為陰性，表明在上樣溶液被D101大孔吸附樹脂柱吸附之后，至少需要使用7 BV的蒸餾水清洗樹脂柱，才能去除糖類成分。

表2 D101大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附水洗體積

2.7 動態(tài)吸附洗脫曲線 將水洗后的樣品，用90%乙醇溶液洗脫，測定不同洗脫體積中的總黃酮的含量，結(jié)果見圖6。使用90%乙醇洗脫D101大孔吸附樹脂中的蘆筍黃酮類化合物，洗脫量先升高再降低，當(dāng)洗脫溶劑達(dá)到60 ml時，洗脫出的總黃酮含量幾乎為零，故而需要使用60 ml 90%乙醇進(jìn)行洗脫。

2.8 驗證試驗 按照優(yōu)化的動態(tài)吸附工藝進(jìn)行上樣于洗脫，測定洗脫液中總黃酮的純度，重復(fù)3次，結(jié)果見表3。蘆筍樣品經(jīng)過D101大孔吸附樹脂純化后，總黃酮的純度提高了6.54倍。

表3 純化工藝驗證

3 討論

大孔吸附樹脂具有價格低廉、吸附性好、反復(fù)利用等特點，在藥材的活性成分分離純化研究中廣泛應(yīng)用[8-9]。D101大孔吸附樹脂為苯乙烯骨架結(jié)構(gòu)的非極性樹脂，對禾本科蘆筍中總黃酮具有較好的靜態(tài)吸附與解吸附性能。黃酮類化合物作為一種天然抗氧化劑，其開發(fā)應(yīng)用有非常大的發(fā)展前景[10]。本研究系統(tǒng)地考察了禾本科蘆筍中總黃酮在D101大孔吸附樹脂上靜態(tài)與動態(tài)吸附性能，優(yōu)選出了總黃酮純化工藝。

禾本科蘆筍中含有黃酮、酚酸、多糖等化學(xué)成分，具有良好的抗癌與抗氧化等活性[11]，而對其黃酮中的具體成分研究較少，比色法進(jìn)行總黃酮含量測定時，通常以蘆丁計，顯色比較穩(wěn)定，測定比較準(zhǔn)確，因而在總黃酮的含量測定中以蘆丁計，為總黃酮含量評價提供經(jīng)典方法。

靜態(tài)吸附量的比較中，本研究考察了蘆筍樣品溶液中總黃酮在三種不同型號大孔樹脂上的靜態(tài)吸附量與解吸率，靜態(tài)吸附量大小關(guān)系為AB-8>D101>HPD100，采用95%乙醇解吸附時解吸率大小順序為HPD100>AB-8>D101?？梢?，D101大孔吸附樹脂對禾本科蘆筍中總黃酮具有較好的靜態(tài)吸附與解吸附性能。大孔吸附樹脂的選擇中，綜合3種樹脂(AB-8、D101、HPD100)對蘆筍總黃酮的靜態(tài)性能分析，最終選擇D101大孔吸附樹脂進(jìn)行動態(tài)性能考察。動態(tài)吸附徑高比考察中，在3個徑高比(1∶3、1∶4、1∶5)下，徑高比為1∶5時，泄漏量最低，可見徑高比為1∶5對蘆筍中總黃酮吸附量較高。D101大孔吸附樹脂的純化工藝可見，乙醇能有效溶解中草藥中的黃酮成分[12]。特別是動態(tài)洗脫時，總黃酮在不同濃度的乙醇中均有洗脫，為了提高洗脫率，選擇90%乙醇進(jìn)行洗脫。進(jìn)行分離純化后，總黃酮純度提高了6.54倍。

綜上所述，D101大孔吸附樹脂對禾本科蘆筍中總黃酮具有較好的靜態(tài)與動態(tài)吸附性能，可以用于禾本科蘆筍中總黃酮的純化，與其他純化方法相比選擇性強、價格合理，為各類中藥中黃酮類化合物的純化工藝研究提供了基礎(chǔ)。