陳宇龐一強

(1. 包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2. 包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；3. 內(nèi)蒙古包頭市第四醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

近年來，我國卒中疾病負擔(dān)日趨加重，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2014年我國腦卒中死亡率達153.61/10萬人，我國卒中死亡人數(shù)占全球的29.4%。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中最為多見[1]。目前救治急性缺血性腦卒中患者最有效的手段是盡早通過血管內(nèi)介入取栓或藥物溶栓，使阻塞血管再通，恢復(fù)腦組織血液循環(huán)，但部分患者隨著血管再通卻引起了缺血區(qū)的二次損傷即腦缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)損傷[2]。I/R腦損傷是多因素參與的極其復(fù)雜的機制，近年來越來越多的研究表明，炎癥反應(yīng)與I/R腦損傷密切相關(guān)[3-5]，小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細胞，約占健康哺乳動物大腦細胞總數(shù)的10%，作為單核-巨噬細胞家族的成員，是神經(jīng)炎癥的主要效應(yīng)細胞之一，具有識別和清除死亡細胞、病原體和一些內(nèi)源性化合物和外源化合物的作用[6]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥體作為研究最廣泛的炎癥體，存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中[7]。最近的研究結(jié)果表明，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在缺血性缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用，抑制NLRP3炎癥小體可對缺血性腦卒中缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用[8]，因此，NLRP3炎癥信號可能是缺血性腦卒中治療的一個潛在的治療靶點。低氧預(yù)適應(yīng)(Hypoxia preconditioning，HPC)是指生物體、系統(tǒng)、器官、組織或細胞暴露于亞致死性低氧/缺血中，導(dǎo)致對隨后發(fā)生的嚴重缺氧/缺血的抵抗力增強的現(xiàn)象[9]。有研究表明[10]，低氧預(yù)適應(yīng)可以明顯減小缺血性腦卒中的梗塞面積，對缺血性腦卒中起到神經(jīng)保護作用。本文則利用小鼠小膠質(zhì)細胞系BV2細胞，利用體外氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)培養(yǎng)，模擬體內(nèi)缺血性腦卒中缺血再灌注損傷過程，觀察低氧預(yù)適應(yīng)是否可以對缺血性腦卒中缺血再灌注損傷起到保護作用，并觀察低氧預(yù)適應(yīng)對其NLRP3蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 BV2細胞(小鼠小膠質(zhì)細胞系，上海拜力生物公司)；DMEM(高糖)培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；DMEM(無糖)培養(yǎng)液基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；青鏈霉素(美國Gibco公司)；MTS活細胞數(shù)量檢測試劑盒(美國Promega公司)；RIPA裂解液(中國Beyotime公司)；BCA法蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)；兔源抗NLRP3抗體(美國CST公司)；鼠源抗β-actin單克隆抗體(美國Santa cruz公司)；驢抗兔HRP結(jié)合二抗(中國Bioss公司)，山羊抗鼠HRP結(jié)合二抗(中國中杉金橋公司)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑(中國Applygen公司)。其余試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.2 方法

1.2.1 BV2細胞的OGD/R培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇BV2細胞，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)至基本融合并鋪滿瓶底80%～90%后，將原培養(yǎng)液倒出，用 PBS 清洗細胞3次，BV2細胞按一定密度接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，用無糖、無血清的DMEM 培養(yǎng)基更換，置于含37℃，1%O2、94%N2、5% CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別進行低氧培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h，然后進行復(fù)氧，即將細胞置于二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)(37℃，95%空氣，5% CO2)2 h，應(yīng)用MTS法測定細胞活力，選擇細胞活力最低的一組作為OGD/R模型。

1.2.2 HPC對BV2細胞OGD/R培養(yǎng)細胞活力的影響 BV2細胞按一定密度接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，進行低氧預(yù)適應(yīng)處理，低氧預(yù)適應(yīng)條件為：A:1%O2低氧30 min/復(fù)氧30 min×4次；B: 1%O2低氧2 h/復(fù)氧2 h；C: 1%O2低氧30 min/復(fù)氧30 min×2次； D: 1%O2低氧1 h/復(fù)氧1 h；之后立即進行OGD/R，應(yīng)用MTS法測定細胞活力，選擇細胞活力最高的一組作為HPC+OGD/R模型。

1.2.3 蛋白免疫印跡檢測不同處理組BV2細胞NLRP3表達的變化 BV2細胞分為4組，分別為常氧(Normoxia，N)組，HPC組，HPC+OGD/R組，OGD/R組，按一定密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞鋪滿培養(yǎng)皿底80%左右，常氧組繼續(xù)置于二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)(37℃，95%空氣，5% CO2)，其余三組按照各組條件進行培養(yǎng)，處理結(jié)束后收集各組培養(yǎng)皿中細胞，按照文獻[11]方法用加有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液輔助超聲波破碎儀將細胞進行裂解提取全細胞裂解液，并用BCA法測定各組蛋白質(zhì)含量，各組樣品以20 μg進行蛋白免疫印跡實驗，檢測NLRP3表達的變化。

2 結(jié)果

2.1 不同OGD培養(yǎng)時間后OGD/R BV2細胞的細胞活力 與常氧(N)組比較，OGD 1 h、2 h、3 h、4 h后復(fù)氧2 h，BV2細胞活力逐漸降低，至OGD 3 h/R 2 h時，細胞活力降至最低(P<0.05)，OGD 4 h/R 2 h與OGD 3 h/R 2 h細胞活力比較差異不大(P>0.05)，故實驗選擇OGD 3h/R 2 h作為體外模擬腦缺血再灌注(OGD/R)模型，見圖1。

注：與N組比較，*P<0.05；OGD 1 h與OGD 2 h比較，#P<0.05；OGD 2 h與OGD 3 h比較，$P<0.05

2.2 不同HPC條件處理后進行OGD 3 h/R 2 h處理的BV2細胞活力 將BV2細胞分為4個不同HPC條件處理組，分別為A：1%O2低氧30 min/復(fù)氧30 min×4次；B：1%O2低氧2 h/復(fù)氧2 h；C：1%O2低氧30 min /復(fù)氧30 min×2次；D：1%O2低氧1 h/復(fù)氧1 h。與對照組(OGD 3 h/R 2 h)比較，4個HPC條件中，1%O2低氧2 h/復(fù)氧2 h+ OGD 3 h/R 2 h細胞活力最高，故后續(xù)實驗選擇1%O2低氧2 h/復(fù)氧2 h+OGD 3 h/R 2 h為體外HPC+OGD/R模型。見圖2。

注：與OGD3 h/R 2 h組比較，*P<0.05；A+OGD 3 h/R 2 h與B+OGD 3 h/R 2 h比較，#P<0.05；B+OGD 3 h/R 2 h與C+OGD 3 h/R 2 h比較，$P<0.05。A:1%O2低氧30 min/復(fù)氧30 min×4次；B:1%O2低氧2 h/復(fù)氧2 h；C:1%O2低氧30 min/復(fù)氧30 min×2次； D:1%O2低氧1 h/復(fù)氧1 h

2.3 不同處理組間NLRP3蛋白表達的變化 與常氧組比較，HPC組NLRP3表達有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，HPC+OGD/R組和OGD/R組NLRP3均高于常氧組和HPC組(P<0.05)；但經(jīng)低氧預(yù)適應(yīng)處理后，HPC+OGD/R組的NLRP3表達明顯低于單純OGD/R組(P<0.05)，見圖3。

注：OGD/R組與HPC+OGD/R組比較，*P<0.05；OGD/R組與N組比較，$$$P<0.001；HPC+OGD/R組與N組比較，##P<0.01；HPC+OGD/R組與HPC組比較，&P<0.05

3 討論

低氧預(yù)適應(yīng)是機體耐受低氧過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性保護機制，其具體機制到目前為止尚不十分明確。呂國蔚教授提出低氧耐受的組織和細胞機制可能是具有腦保護作用“好的基因”表達上調(diào)并使具有腦損傷作用“壞的基因”表達下調(diào)，例如，在已經(jīng)報道的低氧預(yù)適應(yīng)的分子機制中有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、紅細胞生成素(EPO)和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)等這些神經(jīng)保護介質(zhì)上調(diào)[9，12]。本研究則通過體外OGD/R實驗?zāi)M了缺血性腦卒中后的缺血再灌注損傷，并觀察到低氧預(yù)適應(yīng)可以增加OGD/R后的細胞活力，而之前有體內(nèi)實驗研究表明，低氧預(yù)適應(yīng)可以對缺血性腦卒中引起的神經(jīng)損傷起保護作用，其機制可能與對抗缺血性腦卒中的神經(jīng)元凋亡有關(guān)[10]，提示低氧預(yù)適應(yīng)不僅可以對缺血性腦卒中而且對缺血性腦卒中后引起的缺血再灌注損傷起到保護作用。

炎癥小體是近年來發(fā)現(xiàn)的，由模式識別受體參與組裝的多蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)[13]，NLRP3炎癥小體是其中最受關(guān)注的炎癥小體之一，也被認為是神經(jīng)炎癥發(fā)展的關(guān)鍵因素[7]。實驗性缺血性腦卒中后發(fā)現(xiàn)NLRP3蛋白表達增加[14]，伴有IL-1b和IL-18水平升高以及廣泛的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞死亡[15]，而干預(yù)NLRP3激活可減少腦卒中梗死體積并降低神經(jīng)血管損傷水平。由此可見，在缺血性腦卒中缺血再灌注損傷過程中，NLRP3扮演了“壞的基因”， 其介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在缺血/再灌注損傷中也起到十分重要的作用。而在本實驗中，通過對BV2細胞進行OGD/R處理模擬體內(nèi)缺血性腦卒中后的缺血再灌注損傷，觀察到NLRP3表達的升高，而經(jīng)過低氧預(yù)適應(yīng)處理后，可以降低NLRP3的表達，提示低氧預(yù)適應(yīng)可以通過降低NLRP3這一“壞的基因”對缺血性腦卒中缺血再灌注損傷起到保護作用，但具體調(diào)控NLRP3表達的分子機制還需進一步的實驗研究加以明確。