(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2. 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會，廣西 南寧 530021)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)為危重癥科常見疾病，病死率為40%[1]。即使在之前的二十年中，其診治手段獲得了極大的進步，但其死亡率仍然很高[2]。適當(dāng)?shù)闹委煕Q策和資源分配，對ARDS患者預(yù)后的診療至關(guān)重要。然而，病因復(fù)雜導(dǎo)致ARDS的診斷和治療復(fù)雜，為了開發(fā)有效的治療方法，有必要更好地了解ARDS的發(fā)病機制?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) 是一組依賴Zn2+離子并作用于細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶[3]。MMPs具有通過降解細胞外基質(zhì)并影響細胞外基質(zhì)重塑以參與ARDS病理機制進展的能力[4]。本次實驗，我們使用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的大鼠肺損傷的ARDS模型，研究SC514對LPS誘導(dǎo)的ARDS模型大鼠肺組織中MMP-2/9表達的影響，并探討該途徑作為ARDS治療靶標的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠40只，(湖南天勤生物有限公司)，8周齡，每只質(zhì)量(200±10) g。將這些實驗動物全部飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院的SPF級實驗動物房，實驗室溫度設(shè)置為22℃～24℃，濕度恒定在50%～70%，且給予相同標準的經(jīng)過高溫高壓消毒的固體顆粒飼料，以每籠5只，飼養(yǎng)于8只籠子當(dāng)中。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后再進行實驗。本次實驗動物研究已通過右江民族醫(yī)學(xué)院動物保護和使用委員會的審批。

1.2 主要試劑、儀器 LPS(Sigma，L2880)，SC514(GK 01140，MCE)，BCA蛋白定量試劑盒(ZJ101L，上海雅酶有限公司)，磷酸酶抑制劑(GRF102，上海雅酶有限公司)，RIPA裂解液(P0013D，上海碧云天公司)，Omni-EasyTMPAGE凝膠快速制備試劑盒(PG212，上海雅酶有限公司)，p-p65抗體(ab16502，Abcam)，GAPDH抗體 (ab9485，Abcam)，MMP-2抗體(ab97779，Abcam)，MMP-9抗體(ab76003，Abcam)，山羊抗兔IgG(H+ L)二抗(a32731，Thermo Fisher)，DAB顯色試劑盒(DAB-0031，福建邁新公司)，SYBR Green( Roche)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher)，Triol( Thermo Fisher)，BH2生物顯微鏡(Olympus)。

1.3 模型制備分組與標本采集 按照隨機區(qū)間分組設(shè)計的原則將40只SPF級SD大鼠隨機分配到4組內(nèi)，分別為空白對照(NC組)，生理鹽水(CTL)組，LPS組和LPS+SC514組，其中NC組不做任何處理，CTL組中大鼠支氣管滴入生理鹽水1 ml，LPS組中大鼠支氣管滴入LPS10 mg/kg，LPS+SC514組：SC514 10 mg/kg腹腔注射30 min后予以LPS 10 mg/kg支氣管滴入。24 h之后在大鼠腹腔注射水合氯醛溶液，深度麻醉大鼠后，取大鼠右肺上葉，放入甲醛中固定，后做成石蠟包埋病理切片，其余肺組織放入液氮中保存。

1.4 Western Blot檢測NF-κB p65、MMP-2、MMP-9蛋白表達 用4℃的生理鹽水清洗肺組織，加入磷酸化蛋白酶抑制劑RIPA裂解液(10 μl/mg)，勻漿機攪拌，收取勻漿液于1.5 ml EP管中，4℃，11000 r/min離心10 min，收取上清液。按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。每孔取45 μg總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)至PVDF膜；使用快速封閉液在室溫下封閉半小時后，加入相應(yīng)的兔抗鼠一抗抗體(1∶1000)，4℃下?lián)u床孵育過夜。次日，用TBST重復(fù)洗膜3次，每次10 min后，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育40 min。用TBST重復(fù)清洗膜3次，每次10 min。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)上顯影，最后用Image J軟件分析目的條帶。

1.5 免疫組化法檢測肺組織病變 將大鼠肺組織的病理切片依次于二甲苯及不同濃度的乙醇中脫蠟、水化。并用PBS沖洗3 min×3次。放入枸櫞酸溶液中，加熱至95℃，15 min，抗原修復(fù)。PBS沖洗5 min×3次。加入過氧化物酶抑制劑，室溫孵育8 min。PBS沖洗3 min×3次。封閉液封閉，去除封閉液滴加一抗，4℃孵育過夜。PBS沖洗5 min×3次。加二抗，PBS沖洗5 min×3次。滴入辣根過氧化物，PBS潤洗3 min×3次。滴加DAB試劑，后脫水封片。

1.6 實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)法檢測大鼠肺組織MMP-2/9的表達 使用triol法提取總RNA，電泳檢測總RNA的完整性。取0.8 μg總RNA配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。MMP-2/9及GAPDH引物由上海生工合成并驗證。以20 μl為總反應(yīng)體系，GAPDH作為管家基因，每個樣本3個副孔，采用采用2-△△CT法計算MMP-2/MMP-9的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織HE染色及免疫組化觀察結(jié)果比較 NC組即空白組大鼠的肺組織HE染色結(jié)果：肺泡結(jié)構(gòu)較清晰、完整，肺泡間隔無水腫，肺泡腔內(nèi)未見組織液，肺組織中未見炎性細胞浸潤；LPS組肺泡及肺間質(zhì)水腫并有大量炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚并可見肺泡腔縮小變形，部分肺泡塌陷，支氣管腔和肺泡腔可見大量分泌物，肺毛細血管充血水腫；生理鹽水對照組較空白組有少量的炎性細胞浸潤，肺部有輕微損傷，肺微血管內(nèi)皮損傷較輕。SC514組較LPS組損傷程度減輕，少量炎性細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，細胞塌陷較少，出血、滲出較少，肺微血管內(nèi)皮水腫較輕。比較各組大鼠肺組織免疫組化的MMP-2/9表達可見，較多表達在氣道黏膜上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、浸潤的中性粒細胞和巨噬細胞等細胞中。LPS處理導(dǎo)致ARDS大鼠肺組織中MMP-2/9明顯表達增加，SC514預(yù)處理后，降低了ARDS大鼠肺組織中MMP-2/9的表達。見圖1。

2.2 各組大鼠肺組織Western Blot結(jié)果比較 見圖2和圖3，與NC組相比，LPS組中的MMP-2/9蛋白表達明顯增高(P<0.05)，SC514預(yù)處理組中的MMP-2/9蛋白表達與LPS組相比明顯下降(P<0.05)。

2.3 各組大鼠肺組織RT-qPCR結(jié)果比較 見圖4，與NC組對比，LPS組MMP-2/9轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.05)，SC+LPS組與LPS組相比，MMP-2/9轉(zhuǎn)錄水平下降(P<0.05)。

注：*與NC組相比，P<0.05；#與LPS組相比，P<0.05

3 討論

ARDS是失衡的炎癥過程，以炎癥細胞浸潤為主要病理特征，并伴隨肺微血管通透性的增加，以及彌漫性肺間質(zhì)水腫和細胞外基質(zhì)的失衡[5]。其中肺組織內(nèi)的細胞外基質(zhì)對肺的生理功能有重要的作用，細胞外基質(zhì)通常處于一個動態(tài)的平衡中[6]。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是機體的一種重要的水解酶，其特征在于在催化域和幾個保守的蛋白域中具有保守的Zn2+結(jié)合基序[7]。這種重要的蛋白水解酶可降解細胞中的許多成分，與細胞外基質(zhì)的自身穩(wěn)定密切相關(guān)[8]。本課題組前期研究證實，在肺上皮A549細胞中，MMPs和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑有較為廣泛表達，并在炎癥反應(yīng)初期存在著雙向改變[9]。MMPs的活性升高，可造成肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞基底膜的大量破壞[10]，肺組織的通透性增強，發(fā)生肺水腫和呼吸困難。基質(zhì)金屬蛋白酶中的MMP-2和MMP-9可通過信號傳導(dǎo)而參與幾種不同的細胞功能[11]，包括那些與炎癥反應(yīng)有關(guān)的信號傳導(dǎo)。因此，MMP-2/9的失衡可能參與了ARDS病理的進展過程。

過度激活的NF-κB通路可能是ARDS發(fā)病機制的基礎(chǔ)。有研究表明在新生大鼠模型中，NF-κB通路與參與了LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[12]，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶通過抑制ERK1/2降低LPS誘導(dǎo)的大鼠肺損傷[13]。另一項證明重組人腦利鈉肽通過抑制MAPK和NF-κB途徑活化來減輕LPS誘導(dǎo)的人肺成纖維細胞的細胞損傷[14]。根據(jù)這些觀察結(jié)果，本研究表明在ARDS大鼠模型中，肺組織NF-κB通路被異常激活，從而刺激了MMP-2/9的表達并加劇了肺損傷。本次實驗結(jié)果展現(xiàn)了NF-κB/MMP-2/9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸在ARDS相關(guān)炎癥中的作用，這可能會有利于進一步了解該疾病的分子機制。

根據(jù)實驗結(jié)果，LPS組大鼠肺泡中存在大量炎性細胞浸潤，肺泡腔隙縮小變形，并可見大量分泌物及肺間質(zhì)水腫；而SC514組損傷程度均有不同程度的減輕，表明采用支氣管滴注LPS方法復(fù)制大鼠ARDS模型成功。本次研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠肺組織MMP-2/9表達水平較低，LPS干預(yù)后MMP-2/9的蛋白表達水平及轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，進一步實驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用SC514可下調(diào)LPS誘導(dǎo)升高的MMP-2/9表達，這說明MMP-2/9與LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠模型的肺損傷機制關(guān)系密切，值得對其進行深入研究。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)NF-κB通路在LPS誘導(dǎo)的ARDS模型大鼠肺損傷的過程中被明顯激活，SC514的應(yīng)用抑制了NF-κB通路，使MMP-2/9表達水平降低，從而減輕了LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織的炎癥應(yīng)激反應(yīng)。盡管在大鼠的肺組織可以模擬出ARDS的炎癥損傷表現(xiàn)，但ARDS病理機制復(fù)雜，仍需在細胞模型上作進一步探索。