蘭江麗 梁秋梅 馮繼峰 鄭劍秋

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院麻醉科，南寧市 530000，電子郵箱：70588175@qq.com)

膿毒癥是外界病原微生物感染造成的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，可快速進展為膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征(multiple-organ dysfunction syndrome，MODS)，其中肺是膿毒癥的主要靶器官[1-3]。新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，極易受到病原微生物感染，易誘發(fā)膿毒癥，而膿毒癥易進展為膿毒癥休克和MODS，危及患兒的生命[4]。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)具有抗炎、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)等功能[5-6]，能夠顯著抑制膿毒癥肺損傷和MODS的炎癥反應(yīng)，但具體調(diào)節(jié)機制尚不清楚。本研究通過建立脂多糖誘導(dǎo)的新生大鼠膿毒癥肺損傷模型，探討B(tài)MSC移植對膿毒癥肺損傷炎癥反應(yīng)的影響及其可能機制，為新生兒膿毒癥肺損傷的治療和干預(yù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備 磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)和杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基、脂多糖購自美國Sigma-Aldrich 公司(批號：P3288,51435C，SMB00610)；10%特級胎牛血清購自美國HyClone公司(批號：SH30084.03)；白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司(批號：CSB-E08055r、CSB-E04640r、CSB-E11987r)；TRIzol 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：R0016)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)、PCR TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒均由日本Takara公司生產(chǎn)(批號：RR037A、RR820A)；腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)、核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)/p65、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司(批號：13377、14694、8242、5174)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Proteintech Group公司(批號：SA00001-2)，電化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天公司(批號：P0018S)。UV-2100PC型紫外可見分光光度計由美國Unico公司生產(chǎn)，Mx3000P實時熒光PCR儀由美國Agilent生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，Tans-Blot?Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)及ChemiDocTMMP全能型成像系統(tǒng)由美國Bio-Rad?生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物 出生1 d的無特定病原體級SD大鼠60只，雌雄不限，體質(zhì)量20～25 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(粵)-2014-0002。4周齡的無特定病原體級SD大鼠20只，雌雄不限，體重約250 g，均購自廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(桂)2019-0002，實驗前均在動物飼養(yǎng)室馴養(yǎng)兩周，室溫為(25±1)℃，動物自由進食和飲水，并定時更換墊料。

1.3 BMSC的提取與培養(yǎng) 采用文獻[7]的方法進行BMSC的提取與培養(yǎng)。取4周齡的SD大鼠，采用引頸法處死，75%乙醇浸泡5 min后解剖分離出大鼠的股骨和脛骨，浸泡在含有雙抗的DEME培養(yǎng)基中。用含10%特級胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗股骨和脛骨骨髓腔，獲得細(xì)胞懸液約4 mL，4℃下1 200 r/min離心5 min后接種于含DEME培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱進行原代培養(yǎng)。48 h后換液，去除未貼壁細(xì)胞，原代細(xì)胞貼壁80%～90%后傳代培養(yǎng)。取第4代BMSC用于本實驗。

1.4 膿毒癥模型制備及干預(yù)方法 按照隨機數(shù)字表法，將新生SD大鼠隨機分為對照組、膿毒癥組和膿毒癥+BMSC處理組(BMSC組)各20只。膿毒癥組和BMSC 組大鼠，經(jīng)腹腔注射脂多糖(1 mg/kg)構(gòu)建膿毒癥模型[8]，對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。BMSC組在建模后2 h內(nèi)經(jīng)腹腔輸注0.5 mL的BMSC (1×105個細(xì)胞/只)，其余兩組大鼠輸注等量生理鹽水。建模后24 h處死大鼠，暴露胸腔，經(jīng)右心室取血，4℃下1 800 r/min 離心15 min后取血清；結(jié)扎右肺，用預(yù)冷的PBS反復(fù)灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(bronochoalveolar lavage fluid,BALF)。-80℃保存血清、BALF和肺組織待檢。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 肺組織濕/干比的計算及病理學(xué)觀察 取右肺中上葉組織稱取濕重，置60℃烘干箱48 h后稱取干重，計算濕/干比。取右肺下葉組織以10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片及蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變并評分。評分內(nèi)容包括肺泡充血、出血、白細(xì)胞滲出到肺泡腔或血管壁和肺泡壁損傷，均按照 0～4分進行評分[9]，其中少量輕微損傷為0分，輕度損傷為1分，中度損傷為2分，重度損傷為3分，嚴(yán)重?fù)p傷為4分。

1.6 血清及BALF中炎癥因子含量的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清和BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，均按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 肺組織TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65 mRNA表達的檢測 采用TRIzol法提取左肺上葉組織總RNA，UV-2100PC型紫外可見分光光度計測定RNA濃度和純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。采用實時熒光定量PCR檢測TNFR1、VCAM-1、NF-κB/65 RNA的表達水平，反應(yīng)體系包括2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4 15 μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 2.0 μL、PCR上游引物(10 μM)2.0 μL、PCR下游引物(10 μM)2.0 μL、ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)1.0 μL、cDNA 4.0 μL和RNase Free dH2O 4 μL，總體積為30 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；90℃ 3 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。TNFR1上游引物5′-TGAGACGCATTTCCAGTGTG-3′，下游引物5′-AGAATCCTGCGTGGCAGTTA-3′；VCAM-1上游引物5′-CTACATCCACACTGACGCTGAG-3′，下游引物5′-CAGGGAATGAGTAGACCTCCACTT-3′，NF-κB/p65上游引物5′-GATGGGACGACACCTCTACACATA-3′，下游引物5′-CCCAAGAGTCGTCCAGGTCA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAGACGCCAGTA-3′。引物均由日本TaKaRa公司合成。采用相對定量法2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達水平。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測肺組織TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65蛋白表達 采用RIPA和PMSF(按1 mL RIPA/10 μL PMSF/100 mg組織的比例配制)提取左肺下葉組織總蛋白，并采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度后，經(jīng)變性、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉(5%脫脂奶粉封閉液，搖床震動下室溫封閉1 h)后，分別以多克隆TNFR1(1 ∶1 000)、VCAM-1(1 ∶1 500)、NF-κB/p65(1 ∶1 000)和GADPH抗體(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜后采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h。經(jīng)電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影及ChemiDocTMMP 全能型成像系統(tǒng)成像后，測定目的蛋白的灰度值，以目的蛋白與GADPH蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠肺組織濕/干比比較 與對照組比較，膿毒癥組和BMSC組大鼠肺組織濕/干比增加(均P<0.05)；與膿毒癥組比較，BMSC組大鼠肺組織濕/干比降低(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠肺組織濕/干比和病理學(xué)評分比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05。

2.2 3組大鼠肺組織病理學(xué)改變和評分 對照組大鼠肺組織無明顯病理學(xué)改變；膿毒癥組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)顯著充血水腫，肺泡內(nèi)大量炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞滲出；BMSC組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)輕度紊亂，肺間質(zhì)部分充血水腫，肺泡可見少量炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞滲出。與對照組比較，膿毒癥組和BMSC組大鼠肺組織病理學(xué)評分均增加(均P<0.05)；與膿毒癥組比較，BMSC組大鼠肺組織病理學(xué)評分降低(均P<0.05)。見表1和圖1。

對照組 膿毒癥組 BMSC組圖1 光鏡下3組大鼠肺組織病理學(xué)改變(蘇木精-伊紅染色，×100)

2.3 3組大鼠血清及BALF中炎癥因子水平比較 對照組、BMSC組、膿毒癥組大鼠血清及BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均依次升高(均P<0.05)，見表2。

表2 3組大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05。

2.4 3組大鼠肺組織TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65 mRNA和蛋白表達水平比較 對照組、膿毒癥組、BMSC組肺組織TNFR1蛋白及mRNA相對表達水平依次升高；對照組、BMSC組、膿毒癥組肺組織VCAM-1和NF-κB/p65 蛋白及mRNA相對表達水平依次升高 (均P<0.05)，見表3和圖2。

表3 3組肺組織中TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65 mRNA和蛋白表達水平比較(x±s)

注： 與對照組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05。

圖2 3組大鼠肺組織中TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65蛋白的表達

3 討 論

本實驗使用脂多糖建立膿毒癥大鼠模型，膿毒癥組大鼠血清及BALF中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6與TNF-α表達明顯上調(diào)，肺組織水腫并出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變，提示新生大鼠的膿毒癥模型建模成功。BMSC是再生醫(yī)學(xué)中常用的干細(xì)胞，具有抑制炎癥、改善凝血功能、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進缺血組織和血管再生等生物學(xué)效應(yīng)[10-13]。本實驗探討了BMSC對脂多糖所致膿毒癥新生大鼠肺損傷及炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，與膿毒癥組比較，BMSC組大鼠的肺組織濕/干比降低(P<0.05)，肺組織病理學(xué)改變減輕，提示BMSC能夠促進新生大鼠膿毒癥肺損傷的修復(fù)；同時，BMSC組大鼠的細(xì)胞因子IL-1β、IL-6與TNF-α水平低于膿毒癥組(P<0.05)，提示BMSC可抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6與TNF-α的釋放，調(diào)節(jié)機體促炎與抗炎反應(yīng)的平衡，從而促進肺損傷的修復(fù)。

TNFR1是由單核細(xì)胞分泌的蛋白水解蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域可識別TNF-α并與之結(jié)合[14]。有學(xué)者應(yīng)用TNF-α或脂多糖上調(diào)人間充質(zhì)干細(xì)胞的可溶性TNFR1表達后，發(fā)現(xiàn)TNF-α的生物學(xué)效應(yīng)被抑制，提示TNFR1是TNF-α的負(fù)反饋機制之一[15]。Yagi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC通過激活并釋放可溶性TNFR1而抑制脂多糖引起的過度炎癥反應(yīng)和多個靶器官蛋白水解損傷。本研究中，與對照組大鼠相比，膿毒癥組大鼠接受LPS刺激后TNFR1表達上調(diào)，但未達到抑制炎癥因子釋放的水平；與膿毒癥大鼠比較，BMSC處理后膿毒癥新生大鼠肺組織的TNFR1表達上調(diào)，而血清及BALF中TNF-α水平降低(P<0.05)，提示BMSC治療新生大鼠膿毒癥肺損傷的機制可能是通過上調(diào)TNFR1表達而抑制TNF-α等炎癥因子釋放。

VCAM-1是表達在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面的糖蛋白，水解后形成具有生物活性的片段即可溶性VCAM-1[17]。研究表明，TNF-α可刺激免疫活性細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6等炎癥因子，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達VCAM-1，促進白細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮而引起血管內(nèi)皮損傷[18-19]。王春苗等[20]發(fā)現(xiàn)，TNF-α預(yù)處理可明顯提高BMSC的VCAM-1表達及遷移黏附能力，將TNF-α預(yù)處理的BMSC移植于心肌梗死模型大鼠后，大鼠左心室功能增加而梗死心肌細(xì)胞的膠原沉積。本研究的結(jié)果顯示，BMSC組大鼠肺組織VCAM-1 mRNA和蛋白均較膿毒癥組大鼠降低(P<0.05)，提示BMSC或可通過抑制白細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮而減輕血管內(nèi)皮損傷。

NF-κB/p65介導(dǎo)的信號通路如Toll樣受體、蛋白激酶B/腺苷酸激活蛋白激酶參與膿毒癥肺損傷炎癥反應(yīng)的調(diào)控[21-23]。Yagi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥因子刺激激活的上皮細(xì)胞中，BMSC可抑制其NF-κB的激活。本研究結(jié)果顯示，BMSC移植后膿毒癥新生大鼠肺組織NF-κB/p65表達較膿毒癥新生大鼠降低(P<0.05)。因此，BMSC減輕脂多糖肺損傷及炎癥反應(yīng)的機制可能與NF-κB/p65表達受抑制有關(guān)。

綜上所述，BMSC可有效減輕新生大鼠膿毒癥肺損傷及炎癥反應(yīng)，從而促進損傷肺組織的修復(fù)，改善器官功能。BMSC減輕新生大鼠膿毒癥肺損傷的機制可能有以下幾點：(1)上調(diào)TNFR1表達而抑制TNF-α等炎癥因子釋放；(2)降低VCAM-1表達，抑制白細(xì)胞的遷移和黏附；(3)降低NF-κB/p65的表達，抑制炎癥信號通路的傳導(dǎo)。本研究結(jié)果或可為臨床上新生兒膿毒癥肺損傷的治療提供實驗參考依據(jù)。