劉沙沙，付建平，伍鳳姬，郭楚玲，黨志*

1.肇慶學院環(huán)境與化學工程學院，廣東 肇慶 526061；2.華南理工大學環(huán)境與能源學院，廣東 廣州 510006；3.生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學研究所，廣東 廣州 510655

芘是含4個苯環(huán)的多環(huán)芳烴（PAHs）的代表化合物，其能在環(huán)境中長期存在，且檢出濃度較高（張俊葉等，2017；黃河等，2019）。芘具有致癌、致畸和致突變性，會對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成嚴重威脅。微生物修復由于具有成本低、無二次污染等優(yōu)勢已發(fā)展成為一種高效治理PAHs污染的方法。然而，芘的強親脂性導致其生物可利用性較低，這就限制了生物降解的效果。表面活性劑由于具有親水親油的兩相結(jié)構(gòu)，能進一步提高芘在水相中的溶解度，被用作增效劑來促進芘的生物降解過程（Zhang et al.，2013；王鳴等，2016）。但是，近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)表面活性劑并未影響或抑制了芘的生物降解（Mohanty et al.，2012；Zhang et al.，2013；倪賀偉，2014）。

表面活性劑發(fā)揮作用的程度與其種類和特性相關(guān)（Zhang et al.，2013；Liu et al.，2016；Xu et al.，2018），但是不同類型表面活性劑對菌體細胞特性和降解芘的影響尚缺乏系統(tǒng)的研究。本文以微黃分支桿菌Mycobacterium gilvum.CP13為實驗菌株，研究了生物型（皂素）、非離子型（Tween80、TritonX-100、Brij30）、陰離子型（SDS）和陽離子型（CTMAB）表面活性劑對CP13降解芘的影響，并初步探討了相應(yīng)的影響機制，以期為增效微生物修復PAHs污染環(huán)境時選擇合適的表面活性劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試劑：芘，純度＞98%；聚氧乙烯月桂醚（Brij30）、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB），純度＞99.9%，均購于Sigma-Aldrich試劑公司。聚山梨酯-80（Tween80），皂素（Saponin）純度＞99.5%，購于天津科密歐化學試劑公司。表面活性劑和芘的性質(zhì)見表 1。甲醇、乙腈和丙酮均為色譜級，購于上海安譜實驗科技有限公司，其它化學試劑購自于廣州化學試劑公司，AR級。

菌種：芘降解菌為微黃分支桿菌（Mycobacterium gilvum.CP13），是課題組前期從韶關(guān)石化廠焦化廢水活性污泥中篩選得到的革蘭氏陽性菌，橘黃色，短桿狀，菌落光滑，球型，大小約為1.03×0.34 μm。2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.7963（黨志等，2014）。

1.2 培養(yǎng)基和溶液的配制

無機鹽培養(yǎng)基（MSM）的組成如下：5 mL磷酸鹽溶液（KH2PO48.5 g·L-1，K2HPO4·H2O 21.75 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 33.4 g·L-1，NH4Cl 5.0 g·L-1）；3 mL MgSO4溶液（22.5 g·L-1）；1 mL FeCl3溶液（0.25 g·L-1）；1 mL CaCl2溶液（36.4 g·L-1）；1 mL 微量元素液 （MnSO4·H2O 39.9 g·L-1， ZnSO4·7H2O 42.8 g·L-1，(NH4)6Mo7O24·4H2O 34.7 g·L-1），定容至 1 L，pH為7.2—7.4。

芘儲備液：以丙酮為溶劑配制1 g·L-1的芘母液，分別取1 mL加入到進行降解反應(yīng)的搖瓶中，放置 12 h，讓丙酮完全揮發(fā)，使芘的質(zhì)量濃度為50 mg·L-1。

菌懸液配制：將菌體接種于含芘（50 mg·L-1）的MSM培養(yǎng)液中，30 ℃，150 r·min-1預先培養(yǎng)5 d，6000 r·min-1離心 5 min，收集菌體，0.01 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，重懸于250 mL MSM培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)OD600=0.8，用做后續(xù)實驗的菌液（伍鳳姬等，2014）。

1.3 表面活性劑對菌CP13生長和芘降解的影響

將菌懸液（見“1.2”）按體積分數(shù)=10%的比例加入到含有50 mg·L-1芘的MSM培養(yǎng)體系（20 mL）的搖瓶中，皂素、Tween80、TritonX-100、Brij30、SDS和CTMAB的濃度分別設(shè)定為其0、0.2、1、2、4和 8倍的 CMC值，每個處理設(shè) 3個重復。30 ℃，150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)，設(shè)置不加菌的對照組，定時取樣（0、1、2、3、4、5、6 d）分析芘的殘余濃度和CP13的生長量，生長量采用平板菌落計數(shù)法測定。

芘濃度的測定參考伍鳳姬等（2014）的方法：在芘降解后的搖瓶中加入適量的甲醇（色譜級），超聲處理（250 W）30 min，確保其中的芘完全溶解于甲醇后，將其轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶并用甲醇定容，利用孔徑為0.22 μm的有機相針式過濾器過濾后，進高效液相色譜儀（Agilent 1200）測定芘的濃度，波長為 234 nm，流動相為甲醇/超純水（V∶V=90∶10），進樣量 20 μL，流速 1 mL·min-1，停留時間為 4 min。芘的降解率計算公式為：

式中，ρi為不添加菌的對照組中芘的初始質(zhì)量濃度，ρa為不添加菌的對照組中芘的殘留質(zhì)量濃度；ρmi為處理組中芘的初始質(zhì)量濃度，ρma為處理組中芘的殘留質(zhì)量濃度。

表1 表面活性劑和芘的特性1）Table 1 Properties of surfactants and pyrene

1.4 流式細胞儀檢測CP13細胞活性

SYTO9是一種能夠染色細胞膜完整及受損的細胞的綠色熒光核酸染料，而紅色的PI染料只能進入細胞膜通透性改變或者膜結(jié)構(gòu)受損的細胞。當兩種染料同時存在時，PI染料會對SYTO9的熒光強度產(chǎn)生一定的削弱作用，可利用兩者的光譜特征和對細胞染色能力的差異，結(jié)合流式細胞儀檢測各降解體系中完整、受損和死亡細胞的比例，從而可以確定菌體細胞的活性（Olszewska et al.，2019）。

反應(yīng)體系中芘基本降解完后（6 d），20 ℃，6000 rpm，離心10 min，收集CP13菌體，用0.01 mol·L-1的PBS溶液洗滌3次，重懸于1mL PBS溶液中(菌密度調(diào)為 106CFU·mL-1)，加入 3 μL 混合均勻的SYTO9 /PI染色液（比例為1∶1），室溫下避光反應(yīng)15 min后上流式細胞儀檢測。

本實驗所用流式細胞儀為 BD FACSAria型（BD，USA），其運行條件和檢測參數(shù)見表2。PI的紅色熒光和 SYTO9的綠色熒光的檢測激發(fā)光分別為670 nm和530/30 nm，進樣流速為10 μL·min-1，每個樣品計數(shù)10000個細胞左右，利用FACSDiva software軟件對數(shù)據(jù)進行記錄和分析。

表2 BD FACSAria流式細胞儀檢測參數(shù)Table 2 Operating conditions and settings of BD FACSAria flow cytometer

1.5 細胞表面疏水性（CSH）的測定

CSH參照菌體黏著碳烴化合物法（MATH）進行測定（Owsianiak et al.，2009），各培養(yǎng)體系6000 rpm，離心10 min，棄上清液，PBS溶液洗滌菌體3次，重懸，制成菌懸液（OD600,i=1）。取8 mL菌懸液于分液漏斗中，加入4 mL正十六烷，劇烈震蕩1 min，靜置30 min，收集下層水溶液，測定600 nm的吸光度值（OD600,a），計算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 表面活性劑對CP13生長的影響

在CP13降解芘的過程中，不同類型表面活性劑的加入對菌生長的影響存在差異（圖1）。皂素和Tween80對CP13的生長均起到促進作用，說明這兩種表面活性劑對菌CP13沒有毒害作用。皂素的濃度越高，對CP13生長的促進作用越大，在8 CMC時生物量達到最大值 4.95×108CFU·mL-1。隨Tween80濃度從0.2—2 CMC增加，促進作用越強，而在高濃度時（4和8CMC），促進作用減少。但在添加TritonX-100、Brij30、SDS和CTMAB的反應(yīng)體系中，菌CP13的生長受到了抑制，抑制程度與它們的添加濃度成正比。另外，這幾種表面活性劑產(chǎn)生抑制作用的大小程度為CTMAB＞SDS＞Brij30＞TritonX-100。

2.2 表面活性劑對CP13細胞活性的影響

利用121 ℃高壓蒸汽滅菌的CP13細胞作為PI陽性對照，培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體細胞作為SYTO9陽性對照，未染色的細胞為陰性對照，確定死亡、受損及完整細胞在流式圖中所處的位置（張夢露等，2014），如圖2所示。

高濃度（8 CMC）的Tween80、TritonX-100、Brij30、SDS、CTMAB對降解體系中完整、受損和死亡細胞比例的影響如圖3所示。與未添加表面活性劑的體系相比，在添加8 CMC Tween80后，完整細胞的比例減少了 4.7%，受損細胞的比例增加了6.1%，但是，死亡細胞的比例幾乎沒有發(fā)生變化（圖3c）。Zhang et al.（2012）指出 Tween80與細胞膜中流動的磷脂結(jié)合能力較弱，避免了對磷脂雙分子層的擾動，屬于不具備溶膜特性的非均質(zhì)型表面活性劑。Liu et al.（2016）的研究證明了流式細胞儀分析中 Tween80是通過增大細胞膜的通透性而增加了受損細胞比例。同樣的，添加皂素后受損細胞的比例增加了7.9%，死亡細胞變化不大（圖3b）。已有的研究表明皂素對微生物沒有毒性（Kaczorek et al.，2008；Lin et al.，2017，Davin et al.，2017），但能夠增大細胞膜的通透性（Pijanowska et al.，2007）。本研究中 Tween80和皂素只是使CP13的細胞膜通透性增加，并沒有損壞細胞膜的結(jié)構(gòu)而導致死亡，處于受損區(qū)間的細胞仍然保持活性。因此，添加 Tween80和皂素后增加了降解體系中活性細胞的比例，比未添加表面活性劑時分別增加了2.1%和1.4%。

TritonX-100、Brij30、SDS和CTMAB的加入均導致了死亡細胞的比例增多（圖3d—g），分別為6.2%、9.5%、46.7%和67.1%，說明這幾種表面活性劑對菌CP13產(chǎn)生了毒害作用，且CTMAB的毒性最大。TritonX-100和Brij30是容易與細胞膜中的磷脂分子發(fā)生互溶的均質(zhì)型表面活性劑（Nazari et al.，2012），當表面活性劑的濃度達到溶菌濃度時，逐漸將磷脂增溶至液相，形成混合膠束，導致細胞膜逐漸收縮至瓦解消失（Zhang et al.，2013）。Liu et al.（2016）研究指出 Brij30對細胞膜的溶解和破壞能力要大于TritonX-100，因此Brij30的毒性作用要大于TritonX-100。本研究中，添加Brij30后對菌CP13生長和活性的抑制作用要大于TritonX-100。SDS是一種細胞壁抑制劑，能夠與細胞壁、細胞膜發(fā)生物理化學作用，破壞微生物細胞結(jié)構(gòu)的完整性（Garon et al.，2002；李登宇，2016），因此降低了CP13的細胞活性甚至導致其死亡。CTMAB是季銨鹽化合物，由于菌體細胞表面帶負電荷，CP13通過靜電吸引力對CTMAB有很強的吸附作用，不僅阻礙了菌對芘的吸收，而且CTMAB對細胞膜和細胞壁有損傷作用，還對導致菌體蛋白質(zhì)變性（Rodrigues et al.，2013），有很強的殺菌作用，從而使菌CP13大量死亡。

圖2 菌體CP13細胞的陰性對照及陽性對照Fig.2 The dot plots of negative and positive control

圖3 CP13降解芘過程中表面活性劑對細胞活性的影響Fig.3 Effects of surfactants on the cell activity of CP13 during pyrene biodegradation

通過對表面活性劑作用下CP13的生長情況和單細胞特征的分析可知，皂素和Tween80對CP13沒有毒害作用，并且可以促進CP13的生長和活性，皂素的增效作用要大于 Tween80。TritonX-100、Brij30、SDS和CTMAB能夠損害細胞結(jié)構(gòu)，對CP13的生長和活性產(chǎn)生抑制作用。研究指出（李峰，2014；Jin et al.，2017）對菌的毒性大小按生物表面活性劑、非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑的順序而增強。本文結(jié)果與此結(jié)論一致，六種表面活性劑對CP13毒性作用大小的順序為 CTMAB (陽離子)＞SDS (陰離子)＞Brij30 (非離子)＞TritonX-100 (非離子)＞Tween80 (非離子)＞皂素 (生物表面活性劑)。

2.3 表面活性劑對CP13細胞表面疏水性的影響

細胞表面疏水性（CSH）是決定細菌與芘親和性的重要參數(shù)，影響著菌體對芘的吸附，由于表面活性劑同時具有疏水基和親水基，因此可以調(diào)節(jié)CSH，影響菌體對 PAHs的攝取和降解。皂素、Tween80、TritonX-100、Brij30、SDS和CTMAB的加入改變了CP13的CSH（見圖4），CSH變化趨勢取決于表面活性劑的類型和濃度。低濃度的皂素、Tween80和TritonX-100提高了菌株CP13的CSH，Tween80在1CMC達到最大值，皂素和TritonX-100在0.2 CMC達到最大值，隨著濃度的增加，CSH逐漸下降。然而，Brij30、SDS和CTMAB降低了CP13的CSH，添加濃度越高，CSH的下降幅度越大。同樣，Rodrigues et al.（2013）和 Azeredo et al.（2003）的研究也發(fā)現(xiàn)，SDS和CTMAB降低了菌的CSH。

圖4 表面活性劑對CP13細胞表面疏水性（CSH）的影響Fig.4 Effects of surfactants on the cell surface hydrophobicity (CSH) of CP13 during pyrene biodegradation

表面活性劑主要通過兩種方式來改變菌體的CHS：（1）表面活性劑分子在細胞表面的吸附/分配作用，通過改變細胞表面親水疏水電位的比例而使CSH發(fā)生變化，這種方式是可逆的，在一定程度上可以通過多次水洗脫附使細胞的 CSH恢復到初始水平（張棟，2013）；（2）表面活性劑誘導脂多糖從細胞膜外層釋放，由于脂多糖分子中位于細胞外側(cè)的O-抗原為親水結(jié)構(gòu)，它的脫附會使細胞外膜疏水點位暴露（Liu et al.，2014），這會造成細胞膜破損甚至瓦解消失，是不可逆的過程。研究證明（Pijanowska et al.，2007；張棟，2013），皂素和Tween80主要是吸附在菌體表面來改變其CSH，兩者與細胞之間的吸附力是疏水作用的范德華力，不會對細胞膜產(chǎn)生破壞作用，這與流式細胞儀的結(jié)果基本一致。TritonX-100、Brij30、SDS和CTMAB具有溶膜毒性，會導致細胞膜組分的流失，包括親水性的脂多糖和疏水性的膜蛋白等（Garon et al.，2002；Rodrigues et al.，2013；Liu et al.，2016），我們推測它們改變菌體的 CSH是吸附和脫附脂多糖共同作用的結(jié)果，但是到底是哪種作用占主要地位，還需做進一步的研究。此外，鑒于這四種表面活性劑會導致CP13細胞活性的降低，處于游離分散或半休眠狀態(tài)，這可能也是引起CP13的CSH降低的原因之一。

李峰（2014）的研究發(fā)現(xiàn)表面活性劑能夠增加降解菌的CSH而增加菲在菌體細胞上的分配作用。本研究中皂素、Tween80、TritonX-100、Brij30、SDS和CTMAB對菌體CSH的影響規(guī)律與其對CP13降解能力的影響相似，這些現(xiàn)象表明表面活性劑通過改變CSH，影響芘的生物可利用性，改變了CP13細胞與芘的親和力，從而影響了菌對芘的吸附和降解效果。

2.4 表面活性劑對CP13降解芘的影響

圖5顯示了不同種類和濃度的表面活性劑對芘降解過程的影響呈現(xiàn)不同的方式。添加量為0.2和1 CMC的Tween80對芘降解有促進作用，反應(yīng)6 d后，降解率分別達到了90.6%和96.1%，在1CMC時達到最大值；高濃度（4CMC和 8CMC）的Tween80顯著抑制了芘的降解。與本結(jié)果相似的是，Zhang et al.（2013）的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的Tween80能夠促進芘的降解，在濃度為 1 CMC時促進效果最好。結(jié)合CP13細胞特性的變化，推測出Tween80影響芘降解的原因：Tween80對CP13細胞沒有毒害作用，可以促進CP13的生長和細胞活性，使反應(yīng)體系中活性細胞的比例增加，另外，低濃度的Tween80能夠增強CSH，提高了菌體和芘的親和性，從而促進CP13對芘的攝取和降解；Tween80的添加濃度較高時，CSH值降低，菌對芘的吸附能力減弱，芘被包裹在膠束內(nèi)部，微生物對芘的利用率也降低，因此抑制了菌對芘的降解。然而，Ghosh et al.（2016）的研究指出細菌攝取反應(yīng)體系中游離態(tài)的芘與降解菌的 CSH有關(guān)，在表面活性劑添加濃度較高時，菌攝取膠束中芘的能力與表面活性劑的增溶能力和膠束中的芘向水相中轉(zhuǎn)移的速度有關(guān)，與菌體的CSH無關(guān)。這與本文的研究結(jié)果不同，可能是因為表面活性劑和菌的種類不同引起的。

圖5 表面活性劑對CP13降解芘的影響Fig.5 Effects of surfactants on the pyrene biodegradation by CP13

皂素和 TritonX-100影響 CP13降解芘的趨勢基本相同，在0.2 CMC時促進效果最好，但皂素的增效作用明顯大于TritonX-100，皂素使芘的降解率提高了10.7%，濃度高于2 CMC時，呈現(xiàn)出顯著的抑制作用。然而，Soeder et al.（1996）的研究發(fā)現(xiàn)添加50 CMC的皂素加快了假單胞菌對菲和熒蒽的降解速率。與Tween80一樣，皂素對CP13不具有毒性作用，而且增強了CP13的生長和活性。由于皂素具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，添加濃度低于其 CMC值時可以增加細胞膜通透性，促使更多的污染物進入細胞內(nèi)被降解（Zhou et al.，2011）。因此，0.2 CMC皂素增強了CP13對芘的降解主要是由于其增強了細胞膜通透性和CSH，隨著添加濃度的增加，CSH逐漸減小，降低了菌體細胞與芘的親和力，菌對芘的吸附和降解能力減弱。0.2 CMC TritonX-100對芘的降解起到了輕微的促進作用，濃度越高，對芘生物降解的抑制作用越大。Zhang et al.（2013）卻發(fā)現(xiàn) 0.2—8 CMC濃度范圍的 TritonX-100均抑制了芘的降解，因為 TritonX-100會破壞細胞膜導致菌體細胞無法正常維持或充分發(fā)揮其降解功能。本研究2.2中的分析也證實了TritonX-100對菌CP13的溶膜毒性，但濃度為0.2CMC時還未對細胞膜造成嚴重破壞，同時增加了CSH，有利于菌對芘的吸附和降解。

Brij30、SDS和CTMAB抑制了菌CP13對芘的降解，Brij30添加濃度越高，抑制作用越大；添加0.2 CM的SDS時芘還能部分被降解，隨濃度增加，芘幾乎不再降解；即使添加低濃度的CTMAB，也會對芘的降解產(chǎn)生明顯的抑制作用，在添加量為0.2—8 CMC范圍內(nèi)，芘的降解率接近0。這3種表面活性劑對菌 CP13具有毒性作用，不僅抑制了CP13的生長，而且能夠破壞細胞表面結(jié)構(gòu)加快了細胞的死亡，添加Brij30、SDS和CTMAB后導致反應(yīng)體系中活性細胞的比例減少甚至失活，而且還降低了CP13的CSH值，阻礙了菌體對芘的吸附，從而使芘的降解受到抑制。此外，三者對CP13毒性作用的大小為CTMAB＞SDS＞Brij30，因此CTMAB對芘降解的抑制作用最明顯。

3 結(jié)論

（1）皂素和Tween80對CP13沒有毒害作用，可以促進CP13的生長和細胞活性。TritonX-100、Brij30、SDS和CTMAB會損害細胞結(jié)構(gòu)，導致死亡細胞的比例明顯增多，對菌CP13具有毒性。

（2）低濃度的皂素、Tween80和TritonX-100增大了CP13的CSH，隨著濃度的增加，CSH逐漸減??；添加Brij30、SDS和CTMAB后，菌株的CSH呈下降趨勢，濃度越高，CSH的下降幅度越大。

（3）濃度為0.2、1 CMC的Tween80促進了芘的降解，1CMC時芘的降解率提高了 10.3%；0.2 CMC皂素和TritonX-100分別明顯、輕微的促進了CP13對芘的降解，在較高濃度時表現(xiàn)出抑制作用；隨Brij30和SDS添加濃度的增加對芘降解的抑制作用越明顯；添加CTMAB后，芘的生物降解幾乎完全被抑制。

（4）皂素、Tween80、TritonX-100、Brij30、SDS和CTMAB影響菌CP13的降解與其CSH的變化規(guī)律基本一致，其可以通過改變CSH，影響菌體對芘的吸附和攝取。此外，表面活性劑對菌體細胞的毒性作用，也是影響芘降解效果的原因之一。