陳櫻萌，胡滿江，曾鈺鵬，丁藝新，丁靜華，李瑤璐，陳驍熠，蘇立杰

（廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州511436）

腸道菌群是生活在人體腸道內(nèi)細(xì)菌的統(tǒng)稱[1]，種類、數(shù)量眾多，對(duì)機(jī)體健康發(fā)揮著極其重要的作用。腸道菌群協(xié)助機(jī)體抵御致病菌侵襲，參與消化吸收以及免疫調(diào)節(jié)等[2-3]。正常人的腸道菌群相對(duì)穩(wěn)定，但是多種因素諸如飲食習(xí)慣改變、疾病和藥物使用、環(huán)境等均會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[4]。腸道菌群失調(diào)不僅僅是腸道生物屏障損傷，也與腸道化學(xué)屏障、免疫屏障和機(jī)械屏障相關(guān)聯(lián)[5-6]，可能導(dǎo)致消化系統(tǒng)病變、循環(huán)系統(tǒng)疾病及內(nèi)分泌疾病等。調(diào)節(jié)腸道菌群可有效緩解其臨床癥狀。

目前，治療菌群失調(diào)主要采用微生態(tài)制劑[7]，如雙歧桿菌、乳酸桿菌等活菌制劑，但活菌使用存在一定局限，而天然活性物質(zhì)因其環(huán)保、高效、對(duì)機(jī)體損傷小的特點(diǎn)越來(lái)越受到重視。研究表明天然活性產(chǎn)物能夠有效地調(diào)節(jié)胃腸道菌群失調(diào)狀態(tài)，其有效成分可以對(duì)腸道菌群的種類和數(shù)量產(chǎn)生影響，也可以對(duì)腸道菌群定位產(chǎn)生影響。楊帆等[8]研究發(fā)現(xiàn)，菜籽多糖對(duì)小鼠腸道雙歧桿菌和乳桿菌等益生菌有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)大腸桿菌、腸球菌等致病菌有明顯的抑制作用。菊粉干預(yù)后，小鼠雙歧桿菌和乳桿菌的相對(duì)豐度也是顯著增加的[9]。

槲皮素（quercetin）是天然存在的黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于植物的花、葉和果實(shí)中，具有抗氧化[10]、抗炎[11]、抑菌[12]等多種生物活性作用，且長(zhǎng)期食用安全性較高。由于其穩(wěn)定強(qiáng)大的生物活性和廣泛的藥理作用而引起廣泛關(guān)注。槲皮素可通過改變細(xì)胞的通透性、抑制細(xì)菌體內(nèi)酶活性或抑制核酸的合成等途徑發(fā)揮抑菌效果。槲皮素調(diào)節(jié)腸道菌群失衡狀態(tài)，增加擬桿菌和減少變形桿菌，表明其有恢復(fù)宿主微生物平衡的能力[13]。魏希穎等[12]研究槲皮素的體外抑菌效果發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用。而體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)添加一定槲皮素可明顯抑制蛋雞腸道有害菌群大腸桿菌等的生長(zhǎng)，提高益生菌雙歧桿菌的數(shù)量，增加了腸道的競(jìng)爭(zhēng)性保護(hù)能力[14]。這些方法均是對(duì)抑制致病菌的效果進(jìn)行分析，研究槲皮素對(duì)細(xì)菌增殖過程的影響較少，對(duì)槲皮素與益生菌體外增殖、調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)功能的研究也未見報(bào)道。因此擬動(dòng)態(tài)觀察槲皮素在體內(nèi)和體外對(duì)腸道優(yōu)勢(shì)菌增殖的影響，并為輔助調(diào)節(jié)腸道菌群食物的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠（SPF級(jí)Balb/c雄性小鼠，7周齡，健康狀況良好）：廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；槲皮素、鹽酸林可霉素注射液：西安應(yīng)化生物科技有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽七葉苷瓊脂、雙歧桿菌瓊脂、乳桿菌選擇性培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；麗珠腸樂膠囊：珠海麗珠醫(yī)藥；二甲基亞砜（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；革蘭氏染色液、蘇木素染液、伊紅染液：杭州微生物試劑有限公司；苯扎溴銨消毒液：南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司；無(wú)菌厭氧培養(yǎng)袋、厭氧產(chǎn)氣袋、氧氣指示劑：日本三菱化學(xué)公司。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，L-半胱氨酸 0.3 g，加熱。

槲皮素?zé)o菌溶液的制備：精確稱取槲皮素0.00604g，溶于200 μL二甲基亞砜，紫外線常規(guī)照射30 min即得到槲皮素?zé)o菌溶液。

精確稱取槲皮素200、400、800 mg，各加入生理鹽水20 mL，混勻即得10、20、40 mg/mL槲皮素懸濁液。常溫保存，使用前充分搖勻。

取麗珠腸樂膠囊3粒，加入3 mL生理鹽水，混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B微機(jī)生化培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；MULTISKAN GO全自動(dòng)酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌機(jī)：日本三洋電機(jī)集團(tuán)；UV-3900紫外可見分光光度計(jì)：日本日立集團(tuán)；XW-80A漩渦混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DZF-6050真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡：日本奧林巴斯；EG1160石蠟包埋機(jī)、HI1210攤片機(jī)、RM2235石蠟切片機(jī)：徠卡（Leica）儀器（德國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 槲皮素影響小鼠腸道菌群體外增殖的實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1.1 菌種分離

無(wú)菌取小鼠糞便，用無(wú)菌水梯度稀釋至10-4后，分別接種于4種選擇培養(yǎng)基上，按照以下條件進(jìn)行培養(yǎng)。

表1 菌種定向分離條件Table 1 Conditions for directional separation of strains

選擇性培養(yǎng)并鑒定，剔除不符合條件的菌落，其余菌落以無(wú)菌水沖洗后收集，得到目標(biāo)菌種。

1.3.1.2 菌種鑒定

參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版，通過菌落形態(tài)和微生物形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定。

1.3.1.3 定量菌液濃度

以麥?zhǔn)媳葷峁転閰⒄眨瑢⒕N以無(wú)菌水調(diào)整至0.5 MCF，相當(dāng)于108（CFU/mL），待用。

1.3.1.4 光電比濁法

將0.5 MCF的目標(biāo)菌種以10%的接種量分別接種于槲皮素濃度為 0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1（μmol/mL）的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，各取 200 μL置于 96孔板中，37℃厭氧培養(yǎng)。以空白營(yíng)養(yǎng)肉湯為對(duì)照，600 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度（OD值）。每2 h測(cè)定1次，共檢測(cè)24 h。

1.3.1.5 微生物的無(wú)害化處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有一次性耗材浸泡于稀釋后的苯扎溴銨消毒液（苯扎溴銨與水體積比為1∶14）中10 min以上。其余器材121℃高溫高壓滅菌20 min后取出清洗。

1.3.2 槲皮素影響小鼠腸道菌群體內(nèi)增殖的實(shí)驗(yàn)方法

1.3.2.1 腸道菌群失調(diào)模型的構(gòu)造與槲皮素干預(yù)對(duì)小鼠腸道菌群的影響

SPF級(jí)Balb/c雄性小鼠80只，6～8周齡，飼養(yǎng)于清潔環(huán)境中，自由飲水飲食，每天稱重1次。將小鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組（K，20只）和模型組（M，60只），模型組每天10：00和17：00各灌胃鹽酸林可霉素0.3 mL，空白組給予等量生理鹽水，共灌胃3天。造模期間觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、外觀等。

保留空白對(duì)照組（K，10只），將模型組按照體重隨機(jī)分為自然恢復(fù)組（N）、陽(yáng)性對(duì)照組（Y）、低劑量組（D）、中劑量組（Z）和高劑量組（G），每組均為10只。陽(yáng)性對(duì)照組每天給予麗珠腸樂溶液0.3 mL，各劑量組每天灌胃相應(yīng)劑量槲皮素懸濁液（100、200、400 mg/kg BW），空白對(duì)照組和自然恢復(fù)組每天灌胃生理鹽水。

1.3.2.2 樣品的采集與處理

小鼠糞便的采集與處理：在干預(yù)的第1、5、10、15天灌胃前，用無(wú)菌棉簽刺激小鼠肛門，促使小鼠排便。采集小鼠新鮮糞便，將糞便快速放入已滅菌EP管中，取出后立刻進(jìn)行菌群測(cè)定。嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)范，將小鼠糞便放入干燥滅菌的5 mL無(wú)菌EP管中，加入99倍糞便重量的無(wú)菌生理鹽水，然后充分振蕩至糞便分散均勻，制備成10-2糞便稀釋液，備用。

小鼠臟器的采集與處理：干預(yù)結(jié)束后對(duì)小鼠進(jìn)行斷頸椎處死，剖腹，快速取出小鼠脾臟、盲腸和結(jié)腸組織。脾臟、盲腸組織稱重紀(jì)錄。每組取3只小鼠結(jié)腸組織保存于4%多聚甲醛中，其余結(jié)腸組織和所有盲腸迅速用液氮急凍，-80℃凍存。

1.3.2.3 菌群測(cè)定

培養(yǎng)基的配方及制備參照培養(yǎng)基說明書。

1.3.2.4 適宜接種濃度測(cè)定

無(wú)菌環(huán)境下吸取無(wú)菌取10-2糞便稀釋液0.5 mL，加入無(wú)菌生理鹽水4.5 mL充分吹打均勻，即得到10-3糞便稀釋液。以此方法依次得到10-4、10-5、10-6濃度。取 10-3、10-4、10-5、10-6濃度糞便稀釋液，分別吸取 10 μL和20 μL，均勻涂布于選擇培養(yǎng)基上，參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》要求培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)其菌落總數(shù)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行樣。

1.3.2.5 樣本的接種、培養(yǎng)及鑒定

使用涂布法，選擇相應(yīng)樣本的稀釋液10 μL分別接種于4種菌群的相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上，涂布均勻。乳桿菌、雙歧桿菌的培養(yǎng)皿立即裝入有厭氧產(chǎn)氣袋的厭氧培養(yǎng)袋中。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基上各細(xì)菌的鑒定方法見表2。

表2 菌種培養(yǎng)及鑒定方法Table 2 Strain culture and identification method

1）菌落的鑒定

培養(yǎng)后，挑取培養(yǎng)基上菌落，根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢確定目的菌。腸桿菌為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，一般為中等大小的桿菌，端圓，形狀長(zhǎng)短不一；腸球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，形態(tài)類似鏈球菌，為單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的卵圓形；乳酸桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，多數(shù)菌體稍大，直或微彎，成雙或短鏈排列；雙岐桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)芽孢，菌體長(zhǎng)短及形態(tài)不一，多有分叉，常形成Y或V型排列。

2）菌落計(jì)數(shù)

培養(yǎng)結(jié)束后，使用菌落計(jì)數(shù)儀觀察并計(jì)數(shù)各目的菌的菌落數(shù)。根據(jù)平板上的活菌計(jì)數(shù)和稀釋度，按活菌計(jì)數(shù)公式計(jì)數(shù)，結(jié)果以每克糞便或盲腸內(nèi)容物濕重中菌落形成單位的對(duì)數(shù)值表（log10CFU/g）：每克糞便或結(jié)腸內(nèi)容物中菌落數(shù)=log10（菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×每次稀釋取樣毫升數(shù)）/（接種用樣品毫升數(shù)×樣品克數(shù)）。

1.3.2.6 小鼠結(jié)腸組織病理切片制作

1）石蠟切片的制備：殺取小鼠后，快速取出小鼠結(jié)腸，于冷的生理鹽水中漂洗后按如下操作進(jìn)行：固定、脫水、透明、浸蠟包埋、修塊、切片、攤片、烤片及保存。

2）蘇木素-伊紅染色：參考常規(guī)方法操作。

1.3.2.7 結(jié)果判定

依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》規(guī)定，干預(yù)后干預(yù)組與對(duì)照組比較符合以下任一項(xiàng)，差異有顯著性即可以判定該受試樣品具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。

1）糞便中雙歧桿菌和/或乳桿菌明顯增加，腸桿菌、腸球菌無(wú)明顯變化。

2）糞便中雙歧桿菌和/或乳桿菌明顯增加，腸桿菌和/或腸球菌明顯增加，但增加的幅度低于雙歧桿菌/乳桿菌增加的幅度。

2 結(jié)果

2.1 菌種分離結(jié)果

小鼠糞便稀釋后接種在選擇培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，各個(gè)平板上菌落分散生長(zhǎng)，無(wú)重疊黏連，數(shù)量充足。

2.2 菌種鑒定結(jié)果

依據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版對(duì)腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌的描述，對(duì)分離所得菌種菌落形態(tài)和鏡下形態(tài)進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果如表3、圖1、圖2所示。

表3 菌種鑒定結(jié)果Table 3 Results of strain identification

圖1 菌種菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of species

圖2 革蘭氏染色結(jié)果及鏡下形態(tài)Fig.2 Gram staining results and microscopic morphology

本試驗(yàn)分離所得菌種符合《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版對(duì)腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌的描述，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 濁度檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

比濁法檢測(cè)用到的檢測(cè)波長(zhǎng)多為600 nm，也有實(shí)驗(yàn)選用420 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。兩種波長(zhǎng)檢測(cè)原理相同，均通過測(cè)定光透過率檢測(cè)菌體數(shù)目。在420 nm處測(cè)量時(shí)，培養(yǎng)基中色素等成分可能會(huì)影響檢測(cè)準(zhǔn)確性，因此選擇600 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 槲皮素對(duì)腸道菌群體外增殖的影響

連續(xù)測(cè)定不同菌群在 0、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μmol/mL濃度槲皮素作用下24 h內(nèi)OD600的變化，制成24 h生長(zhǎng)曲線，動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)槲皮素對(duì)致病菌和益生菌菌群體外增殖的影響。

2.4.1 不同濃度槲皮素對(duì)致病菌體外增殖影響

不同濃度槲皮素對(duì)腸球菌體外增殖的影響見圖3。

圖3 不同濃度槲皮素對(duì)腸球菌體外增殖的影響Fig.3 Effects of different concentrations of quercetin on the proliferation of enterococcus in vitro

如圖3所示，黑色折線代表空白組腸球菌的體外增殖情況，紅色折線代表槲皮素干預(yù)下腸球菌的體外增殖情況。0.01 μmol/mL槲皮素（圖3A）在10 h左右雖然促進(jìn)了腸球菌的增殖，但是在14 h左右后其生長(zhǎng)曲線明顯呈下降趨勢(shì)，18 h后腸球菌的增殖程度明顯低于空白組。0.05、0.1、0.5、1 μmol/mL 槲皮素干預(yù)組（圖3B、C、D、E）腸球菌生長(zhǎng)曲線基本水平，隨時(shí)間只有小幅度增長(zhǎng)。經(jīng)培養(yǎng)，所有干預(yù)組腸球菌生長(zhǎng)曲線均明顯低于空白組腸球菌，表明所有濃度的槲皮素均對(duì)腸球菌的增殖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。不同濃度槲皮素對(duì)腸桿菌體外增殖的影響見圖4。

圖4 不同濃度槲皮素對(duì)腸桿菌體外增殖的影響Fig.4 Effects of different concentrations of quercetin on the proliferation of e.coli in vitro

如圖4所示，黑色折線代表空白組腸桿菌的體外增殖情況，紅色折線代表槲皮素干預(yù)下腸桿菌的體外增殖情況。24 h內(nèi)各個(gè)干預(yù)組腸桿菌的生長(zhǎng)曲線與空白組趨勢(shì)基本一致，各個(gè)干預(yù)組腸桿菌的生長(zhǎng)曲線多數(shù)在空白組之下，24 h時(shí)所有干預(yù)組的腸桿菌OD600均小于空白組，槲皮素對(duì)腸桿菌的增殖抑制效果雖并不明顯，但也未表現(xiàn)出扶植作用。

2.4.2 不同濃度槲皮素對(duì)益生菌體外增殖影響

不同濃度槲皮素對(duì)雙歧桿菌體外增殖的影響見圖5。

圖5 不同濃度槲皮素對(duì)雙歧桿菌體外增殖的影響Fig.5 Effects of different concentrations of quercetin on the proliferation of bifidobacteria in vitro

如圖5所示，黑色折線代表空白組雙歧桿菌的體外增殖情況，紅色折線代表槲皮素干預(yù)下雙歧桿菌的體外增殖情況。24 h內(nèi)各個(gè)干預(yù)組雙歧桿菌的生長(zhǎng)曲線與空白組趨勢(shì)基本一致，各個(gè)干預(yù)組雙歧桿菌的生長(zhǎng)曲線多數(shù)在空白組之上，24 h時(shí)所有干預(yù)組的雙歧桿菌OD600基本都小于空白組，槲皮素對(duì)雙歧桿菌并無(wú)抑制效果，但也未表現(xiàn)出較明顯的扶植作用。不同濃度槲皮素對(duì)乳桿菌體外增殖的影響見圖6。

圖6 不同濃度槲皮素對(duì)乳桿菌體外增殖的影響Fig.6 Effects of different concentrations of quercetin on the proliferation of lactobacillus in vitro

如圖6所示，黑色折線代表空白組乳桿菌的體外增殖情況，紅色折線代表槲皮素干預(yù)下乳桿菌的體外增殖情況。0.01、0.05、0.1 μmol/mL 濃度槲皮素組（圖6A、B、C）乳桿菌的生長(zhǎng)曲線明顯高于空白組乳桿菌生長(zhǎng)曲線，其中0.01 μmol/mL濃度槲皮素（圖6A）在8 h～12 h可加速乳桿菌的增殖，0.05 μmol/mL濃度槲皮素（圖6B）在15 h～24 h可加速乳桿菌的增殖，但對(duì)其最終總濃度并未產(chǎn)生明顯影響，0.1 μmol/mL濃度槲皮素（圖6C）不僅在15 h后加速乳桿菌的增殖，還明顯提高了乳桿菌的最終濃度，表現(xiàn)出較強(qiáng)的扶植作用；而 0.5、1 μmol/mL 濃度槲皮素（圖 6D、E）則對(duì)乳桿菌表現(xiàn)為較強(qiáng)的抑制作用。

槲皮素滲入細(xì)菌內(nèi)會(huì)降低細(xì)胞液pH值殺滅細(xì)菌[15]。乳桿菌具有較強(qiáng)的耐酸性，因此一定濃度范圍內(nèi)槲皮素干預(yù)下，槲皮素?zé)o法抑制乳桿菌增殖，但是乳桿菌增殖被扶植的原因仍需進(jìn)一步探索。過高濃度的槲皮素依然會(huì)抑制其體外增殖，可能與槲皮素破壞細(xì)胞壁的能力有關(guān)。

2.5 接種濃度的測(cè)定結(jié)果

選擇在培養(yǎng)基上出現(xiàn)50 CFU～300 CFU菌落的稀釋度為接種稀釋度。最后確定乳桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌接種稀釋度為10-5，腸球菌接種稀釋度為10-4，接種量為10 μL時(shí)，觀察效果最佳。

2.6 菌群失調(diào)小鼠模型造模效果評(píng)價(jià)

2.6.1 造模后小鼠一般情況

造模3 d后，空白組小鼠（生理鹽水灌胃）精神狀態(tài)好，活動(dòng)正常，毛發(fā)光潔整齊，外觀及排便情況無(wú)異常；模型組小鼠（鹽酸林可霉素灌胃）精神狀態(tài)較差，活動(dòng)量減少且活動(dòng)緩慢，毛發(fā)黏結(jié)成束且缺少光澤，活動(dòng)時(shí)背部皮膚輕易可見，小鼠有腹瀉癥狀，糞便較稀不易成型，肛門附近有較多糞便殘留。

2.6.2 造模后腸道菌群測(cè)定

醫(yī)學(xué)上用B/E值（雙歧桿菌/腸桿菌）來(lái)評(píng)估腸道菌群的情況，如果B/E比值大于1則說明腸道菌群處于平衡狀態(tài)，如果B/E比值小于1則說明腸道菌群處于失衡狀態(tài)，比值越小說明菌群失衡越嚴(yán)重。如表4所示，造模后空白組小鼠B/E值為1.15，腸道菌群平衡，而模型組小鼠B/E值為0.99，說明鹽酸林可霉素灌胃導(dǎo)致了小鼠B/E值下降，造成了小鼠腸道菌群失衡。

表4 造模后腸桿菌與雙歧桿菌數(shù)量Table 4 Enterobacteriaceae and bifidobacteria after model establishment

2.6.3 造模后小鼠臟器比變化

解剖后可見，空白組小鼠消化道顏色呈粉紅色，具有較好的彈性；模型組與空白組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，小鼠消化道顏色蒼白，腸壁組織變薄易斷，盲腸腫大明顯，造模后小鼠盲腸臟器比顯著大于空白對(duì)照組（P＜0.05）（如圖7）。

圖7 造模后小鼠盲腸臟器比Fig.7 Cecum organ ratio in mice after model establishment

2.6.4 菌群失調(diào)小鼠模型造模后病理切片結(jié)果

觀察造模后小鼠結(jié)腸組織蘇木素-伊紅染色結(jié)果見圖8。

圖8 造模后小鼠腸道蘇木素-伊紅染色（×100）Fig.8 Intestinal hematoxylin-eosin staining in mice after model establishment

鹽酸林可霉素造模3 d后，空白組小鼠結(jié)腸組織腺體大小正常，結(jié)腸上皮完整，細(xì)胞緊密。模型組小鼠結(jié)腸絨毛減少，腺體變少且萎縮，結(jié)腸上皮受損，細(xì)胞連接有間斷。

2.7 槲皮素干預(yù)對(duì)小鼠糞便中菌群的影響

槲皮素干預(yù)后第1次檢測(cè)小鼠腸道菌群情況見圖9。

圖9 槲皮素干預(yù)后第1次檢測(cè)小鼠腸道菌群情況Fig.9 Detection of intestinal flora in mice for the first time after quercetin intervention

干預(yù)后第5天時(shí)第1次檢測(cè)菌群情況。與空白組相比，所有組別小鼠糞便中腸球菌、腸桿菌數(shù)目都有所增加（圖9A、B）但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與空白組相比，所有組別小鼠糞便中雙歧桿菌的數(shù)目都有所增加（圖9C），且陽(yáng)性對(duì)照組、中劑量組和高劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與空白組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組和高劑量組小鼠糞便乳桿菌數(shù)目增多，自然恢復(fù)組和中劑量組小鼠糞便乳桿菌數(shù)目減少（圖9D），但變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》規(guī)定可判斷：干預(yù)后第5天時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組、槲皮素干預(yù)中劑量組和高劑量組即表現(xiàn)出調(diào)節(jié)腸道菌群能力。槲皮素干預(yù)后第2次檢測(cè)小鼠腸道菌群情況見圖10。

圖10 槲皮素干預(yù)后第2次檢測(cè)小鼠腸道菌群情況Fig.10 Detection of intestinal flora in mice for the second time after quercetin intervention

干預(yù)后第10天時(shí)，第二次檢測(cè)菌群情況。與空白組相比，所有組別小鼠糞便中腸球菌、腸桿菌數(shù)目都有所增加（圖10A、B），只有陽(yáng)性對(duì)照組小鼠糞便中腸桿菌增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與空白組相比，所有組別小鼠糞便中雙歧桿菌的數(shù)目都有所增加（圖10C），所有結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與空白組相比，所有組別小鼠糞便雙歧桿菌數(shù)目均下降（圖10D），陽(yáng)性對(duì)照組雙歧桿菌數(shù)目下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。因此，干預(yù)后第10天各槲皮素干預(yù)組小鼠的腸道菌群與空白對(duì)照組和自然恢復(fù)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是所有組別小鼠的條件致病菌（腸球菌和腸桿菌）數(shù)量均比空白對(duì)照組有明顯升高，而各組間雙歧桿菌數(shù)目變化不明顯，乳桿菌數(shù)目反而下降。

槲皮素干預(yù)后第10天時(shí)，自然恢復(fù)組菌群與空白組即無(wú)顯著差異，說明鹽酸林可霉素灌胃對(duì)腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌造成的菌群失調(diào)是可以自然恢復(fù)的，但腸道菌群種類眾多，并不能確定鹽酸林可霉素是否影響腸道菌群的物種豐度及其多樣性，以及物種豐度和多樣性是否可以自然恢復(fù)到菌群失調(diào)前水平，需進(jìn)一步通過16s rDNA測(cè)序進(jìn)行探索。槲皮素干預(yù)后第3次檢測(cè)小鼠腸道菌群情況見圖11。

圖11 槲皮素干預(yù)后第3次檢測(cè)小鼠腸道菌群情況Fig.11 Detection of intestinal flora in mice for the third time after quercetin intervention

干預(yù)后第15天時(shí)，第3次檢測(cè)菌群情況。與空白組相比，所有組別小鼠糞便中腸球菌數(shù)目都有所增加（圖11A），但只有自然恢復(fù)組的升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與空白組相比，所有組別小鼠糞便腸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)目都有所增加（圖11B、C），但結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與空白組相比，其余所有組別小鼠糞便乳桿菌數(shù)目均減少（圖11D），但變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

3 結(jié)論

槲皮素在自然界中存在廣泛，成本低廉且易于保藏及加工。對(duì)槲皮素調(diào)節(jié)腸道菌群效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)槲皮素對(duì)乳桿菌體外增殖有明顯扶植作用，超過范圍時(shí)對(duì)乳桿菌增殖強(qiáng)烈抑制；槲皮素對(duì)腸球菌體外增殖均表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用，對(duì)腸桿菌和雙歧桿菌體外增殖無(wú)明顯的抑制作用但也不表現(xiàn)出扶植作用。200 mg/kg BW和400 mg/kg BW槲皮素可增加小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量。以上結(jié)果說明，槲皮素可調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)狀態(tài)。