盧 祎，高有領(lǐng)，王水濤，何盛盛

(浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，可以與靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)結(jié)合從而抑制靶基因的翻譯或降解靶基因，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，并最終影響蛋白質(zhì)的合成。miRNA多在基因間隔區(qū)、內(nèi)含子、編碼蛋白的外顯子區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生[1-2]，在生物體內(nèi)構(gòu)成一個(gè)極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。有研究表明，miRNA參與了發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、激素分泌、脂類代謝，以及腫瘤發(fā)生、糖尿病和病毒感染等多種生理和病理過(guò)程[3-4]。也有證據(jù)表明，miRNA是脂質(zhì)合成、脂肪酸氧化及脂蛋白形成和分泌的關(guān)鍵調(diào)控因子。脂類代謝有關(guān)的miRNA種類較多，目前研究主要集中于miR-33、miR-122等，其調(diào)控方式主要是通過(guò)調(diào)節(jié)與脂類合成和氧化相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)脂類代謝[5]。miR-499已知與人的急性心肌梗死[6]、豬氧化肌纖維的形成[7]和人肺癌的發(fā)生[8]有關(guān)，但目前尚無(wú)研究證實(shí)與脂類代謝相關(guān)。本研究以中華鱉為試驗(yàn)動(dòng)物，旨在研究miR-499對(duì)中華鱉脂類代謝相關(guān)基因的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 miR-499 antagomirs 和miRNA-499

miR-499 antagomirs由生工生物工程(上海)股份有限公司制備，對(duì)其進(jìn)行3′端膽固醇修飾、3′端4個(gè)硫代骨架修飾、5′端2個(gè)硫代骨架修飾、全鏈2′甲基化修飾[9]。miRNA-499序列為：5′-TTAAGACTTGCAGTGATGTTTA-3′；miR-499 antagomirs序列為：5′-tsasaacatcactgcaagtctstsasas-Chol-3′(小寫字母表示2′-O-甲基修飾的核苷酸，下標(biāo)“s”表示硫代磷酸酯鍵，“Chol”表示通過(guò)羥基脯氨酸鍵連接的膽固醇)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用中華鱉為2019年孵化的健康稚鱉，購(gòu)于浙江省湖州市的養(yǎng)殖場(chǎng)，試驗(yàn)在浙江萬(wàn)里學(xué)院生態(tài)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.3 主要試劑

甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和總蛋白(total protein，TP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Trizol購(gòu)自Ambion公司；RevertAid First Strand cDNA試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司；Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit、TB GreenTMPremix ExTaqTMII購(gòu)自TaKaRa Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取15只健康稚鱉，體質(zhì)量(52.04±6.28)g，隨機(jī)分成3組，分別為空白對(duì)照組、注射生理鹽水組、注射miR-499 antagomirs組，每組5只中華鱉。分組后，進(jìn)行暫養(yǎng)馴化，7 d后進(jìn)行腹腔注射。試驗(yàn)期間，中華鱉每天早晚(09：00和19：30)各投喂1次，定時(shí)檢測(cè)水質(zhì)，每天換水，水溫保持在28～30 ℃，水中溶解氧含量大于5 mg·L-1，氨基氮小于0.01 mg·L-1，光照周期為12 L/12 D。

1.2.2 中華鱉腹腔注射與樣品采集

注射開始前，用少量DEPC水溶解antagomirs，注射劑量為每只每次13.2 μg，生理鹽水組注射200 μL 0.65% NaCl溶液。采用腹腔注射(圖1)，具體注射過(guò)程如下：擦干體表水后翻轉(zhuǎn)中華鱉，使腹部朝上，拉開一側(cè)后肢，露出后肢根部無(wú)腹甲覆蓋處的皮膚(進(jìn)針位置)，用酒精棉球消毒。選取2 mL注射器吸取注射液，進(jìn)針?lè)较驗(yàn)樗较蛐穆詡?cè)向背甲，與中華鱉腹部正中線呈45°，進(jìn)針深度1.5 cm左右，然后緩緩注入注射液。試驗(yàn)時(shí)，在同一時(shí)間連續(xù)注射3 d，最后1次注射后24 h采樣。中華鱉解剖后，采集血液，離心后分離血漿，迅速分離肝臟組織，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.3 血清與肝臟中甘油三酯和總膽固醇含量測(cè)定

紅色箭頭所示為注射部位。The red arrow showed the injection site.圖1 腹腔注射示意圖Fig.1 Diagram of intraperitoneal injection

采用試劑盒測(cè)定中華鱉血清和肝臟中甘油三酯、總膽固醇和總蛋白含量，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 脂類代謝基因表達(dá)分析

用Trizol提取中華鱉肝臟總RNA，使用具有Oligo(dT)18引物的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；使用Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄microRNA。用TB GreenTMPremix ExTaqTMII試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，以β-actin和U6為內(nèi)參基因，目的基因及內(nèi)參基因引物序列見表1。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；65 ℃反應(yīng)5 s，95 ℃反應(yīng)5 s。用熒光定量PCR方法分別對(duì)脂類代謝相關(guān)基因甲狀腺激素應(yīng)答蛋白(THRSP)、?；o酶A氧化酶1(ACOX1)、乙酰輔酶A羧化酶A(ACACA)、固醇調(diào)控元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBF1)、脂肪酸合成酶(FASN)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)、?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員1(ACSL1)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)和鈉/碘共同轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。

表1 引物信息

Table 1 Primer information

基因Gene引物名稱Primers name引物序列Sequence(5’-3’)THRSPTHRSP-5-49CAACAGCCAGCATCCCTTHRSP-3-289GACCCTCCATCGCAAGTFASNFASN-5-3575TCCTGGTCTCCTAAACACTCAFASN-3-3871TCGCCAAGCATTTCTCCTACSL1ACSL1-5-649TGACAATGGCTGGTGACACSL1-3-936CCTGTGCGAGTTTGAATATCPT1CPT1-q5-1033GCCGTTATTTCAAAGTCTGTCCPT1-q3-1307ATCCTCTTCCCTGTATCCCTSREBF1SREBF1-5-3773TATTGGTCCATTTCTCCAGCCTTCTSREBF1-3-4097CCAGCACTAACACTGAGCCCTTCFABPFABP-5-152AAAGGGCAAGGACATCAFABP-3-309CAACAGCCTTGACCTTCTACOX1ACOX1-5-295GACTGCAAGGTTCCTGGTCACOX1-3-552CATGAATCCTCCTGGCTCACACAACACA-5-1278TGCGACCTTAGTGGTGTTTACACA-3-1529ATTACGCGGATGTCTTTGAPPARγPPAR-5-80TCACTCCCATTCCTTCGPPAR-3-393AAGCCTTGTCTCCACATACNISNIS-5-144TCAGCGGCGTTTGATTGAGNIS-3-456ACACCCAGAAATGTCCGAGAACmiR-499aca-miR-499-5pTTAAGACTTGCAGTGATGTTTAβ-actinβ-ACTIN-5-162TCCTGACAGAAAGAGGCTACAβ-ACTIN-3-382GGATGGCTGGAAGAGGGU6U6FCTCGCTTCGGCAGCACAU6RAACGCTTCACGAATTTGCGT

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用2-ΔΔCt方法對(duì)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別以β-actin和U6基因的表達(dá)水平作為中華鱉脂類代謝基因和miRNA表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清中甘油三酯和總膽固醇含量

相對(duì)于空白對(duì)照組和生理鹽水注射組，注射miR-499 antagomirs組中華鱉稚鱉血清中總膽固醇含量顯著升高(P<0.05)，但是甘油三酯含量無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2)。

2.2 肝臟中甘油三酯和總膽固醇含量測(cè)定

相對(duì)于空白對(duì)照組和注射生理鹽水組，注射miR-499 antagomirs組中華鱉稚鱉肝臟中甘油三酯和總膽固醇含量均無(wú)顯著差異(圖3)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注*表示與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。下圖同。Value columns with * symbol meant significant difference compared to the control (P<0.05). The same as below.圖2 MiR-499 antagomirs對(duì)中華鱉稚鱉血清中甘油三酯和總膽固醇水平的影響Fig.2 Effects of miR-499 antagomirs on serum triglyceride and total cholesterol level of Pelodiscus sinensis

圖3 miR-499 antagomirs對(duì)中華鱉稚鱉肝臟中甘油三酯和總膽固醇水平的影響Fig.3 Effects of miR-499 antagomirs on liver triglyceride and total cholesterol level of Pelodiscus sinensis

2.3 脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

Antagomirs組miR-499的相對(duì)表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和生理鹽水組(圖4)。中華鱉肝臟脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)量見圖5，相對(duì)于空白對(duì)照組和注射生理鹽水組，注射miR-499 antagomirs組THRSP和NIS表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，CPT1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，ACOX1、ACACA、ACSL1、FABP、FASN、SREBF1和PPAR表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖4 miR-499基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of miR-499 gene

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中，相對(duì)于空白對(duì)照組和注射生理鹽水組，注射miR-499 antagomirs對(duì)稚鱉血清和肝臟中甘油三酯含量無(wú)顯著影響，這與張犁蘋[10]的研究結(jié)果相似。注射miR-499 antagomirs組稚鱉血清中總膽固醇含量顯著升高，提示miR-499 antagomirs增加了中華鱉血清中膽固醇含量，說(shuō)明miR-499可能與膽固醇生成有關(guān)，這與zhang等[11]的研究結(jié)果一致。注射miR-499 antagomirs顯著降低了中華鱉肝臟中miR-499基因的相對(duì)表達(dá)量，表明antagomirs成功抑制稚鱉體內(nèi)miR-499的表達(dá)，該結(jié)果與Chu等[12]和楊峰[13]的研究結(jié)果一致，上述作者采用相應(yīng)的antagomirs分別成功地抑制了miR-126、miR-33和miR-122的表達(dá)。THRSP基因在哺乳動(dòng)物的肝臟、脂肪和乳腺等脂肪生成組織中高度表達(dá)，在脂肪合成過(guò)程中具有重要調(diào)控作用[14]。鈉/碘共同轉(zhuǎn)運(yùn)體是一種跨膜糖蛋白，NIS基因在甲狀腺中高度表達(dá)，主要功能是調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞攝取碘分子[15-16]。CPT1是脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵限速酶[17]。本試驗(yàn)中，注射antagomirs引起中華鱉肝臟中THRSP基因表達(dá)水平顯著升高和CPT1基因表達(dá)水平顯著降低，表明中華鱉肝臟中脂肪合成增加，脂肪酸β-氧化減弱，說(shuō)明了miR-499具有調(diào)節(jié)中華鱉脂肪生成和β-氧化的作用。

圖5 miR-499 antagomirs對(duì)中華鱉脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of miR-499 antagomirs on lipid metabolism-related genes expression level of Pelodiscus sinensis

有關(guān)miRNA-499的研究多集中在腫瘤、心腦血管等疾病方面[18-20]。有研究表明，miRNA-499與心肌梗死[21-22]、冠心病[23]、心房顫動(dòng)[24-25]、心肌細(xì)胞缺血損傷[26-28]等心血管疾病相關(guān)。也有研究表明，miRNA-499與缺血性腦卒中的腦供血障礙性疾病有關(guān)[29]。脂質(zhì)代謝紊亂是引起各種心、腦、血管疾病的重要啟動(dòng)因素，如膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)和脂肪酸過(guò)氧化等可引起腦卒中、冠心病、脂肪肝、肥胖癥等多種疾病[30]。miRNA-499與心、腦、血管疾病具有相關(guān)性，而脂質(zhì)代謝紊亂與心、腦、血管疾病也有密切聯(lián)系，因此miRNA-499可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，從而參與調(diào)節(jié)心、腦、血管疾病發(fā)病的發(fā)生。Zhang等[11]的研究證實(shí)了這一點(diǎn)，他們用miR-449模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-449通過(guò)抑制沉默接合型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(SIRT1)和膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1c)表達(dá)，下調(diào)其靶基因脂肪酸合成酶基因(FASN)表達(dá)，控制肝癌細(xì)胞的脂肪生成和膽固醇生成，從而抑制肝癌細(xì)胞的DNA合成、有絲分裂進(jìn)入和增殖，這也佐證了本試驗(yàn)的推斷，即miR-499參與調(diào)節(jié)中華鱉肝臟脂肪生成和脂肪酸β-氧化的過(guò)程。

體內(nèi)注射miR-499 antagomirs上調(diào)了中華鱉脂肪合成相關(guān)基因(THRSP和NIS)表達(dá)水平，下調(diào)了脂肪酸β-氧化相關(guān)基因(CPT1)的表達(dá)水平，表明miRNA-499與中華鱉脂肪生成和脂肪酸β-氧化有關(guān)。