李 寧 毛惠寧 丘 映 史秋雯 周英惠 李慕軍

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南寧市 530031，電子郵箱：747190546@qq.com；2 廣西南寧市上林縣人民醫(yī)院婦科，南寧市 530500；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院婦科，南寧市 530011；4 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南寧市 530021)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)病因復(fù)雜，約有50%以上的RSA患者發(fā)病原因不明，稱為不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[1]。目前，研究已證實(shí)免疫失衡在RSA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，其中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-23/IL-17炎癥軸通路與RSA的免疫紊亂機(jī)制有關(guān)[2]。近年來，維生素D的免疫調(diào)節(jié)作用是國內(nèi)外研究的新方向。研究表明維生素D能通過多種途徑抑制IL-17的產(chǎn)生，并在器官移植、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘等自身免疫性疾病中取得了較好的治療效果[3]。此外，維生素D在女性生殖和妊娠過程中也發(fā)揮重要作用，RSA患者血漿維生素D水平低于正常妊娠者[4]。但維生素D是如何參與正常和異常的生殖和妊娠過程，機(jī)制仍不清楚。蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(decidual stromal cell，DSC)是母-胎界面非常重要的細(xì)胞組成成分，早孕期的DSC既能營養(yǎng)胚胎，又參與滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、遷移過程，還具有免疫調(diào)節(jié)作用[5]。然而，目前關(guān)于DSC的研究相對(duì)較少，尤其是維生素D是否影響人類妊娠早期DSC的IL-17、IL-23分泌水平，未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過分離培養(yǎng)RSA患者早孕期DSC，分析DSC分泌IL-17、IL-23的水平以及維生素D在其中的影響，探討維生素D治療RSA的作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2016年4月至2016年11月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的5例妊娠6～8周RSA患者，年齡(30.60±3.08)歲；另選擇同期因計(jì)劃外妊娠行人工流產(chǎn)的5例正常妊娠婦女，年齡(29.00±4.03)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)RSA患者，流產(chǎn)次數(shù)均≥2次，本次和既往妊娠期間行B超動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)未見胚胎心管搏動(dòng)或者胎心搏動(dòng)停止；(2)正常妊娠婦女，既往均無不良孕產(chǎn)史，本次妊娠期間無腹痛、陰道流血等先兆流產(chǎn)的癥狀和體征，經(jīng)B超檢查明確宮內(nèi)活胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)RSA患者，夫妻雙方任意一方染色體異常；(2)兩組研究對(duì)象均排除生殖道發(fā)育畸形、感染性疾病、內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病等患者。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑 熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：BX63) ，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國BioTek公司，型號(hào)：ELx800)，Ⅳ型膠原酶(美國Sigma公司，批號(hào)：WXBC0544V)，IL-17和IL-23酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：CSB-E12819h、CSB-E08461h)，Percoll細(xì)胞分離液(北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：417E1046)，1,25-二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25-(OH)2D3](美國Sigma公司，批號(hào)：96M4039V)，鼠抗人波形蛋白單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，批號(hào)：MAB-0735)，鼠抗人角蛋白-7單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，批號(hào)：MAB-0828)，即用型免疫組化超敏檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：KIT-9710)。

1.3 方法

1.3.1 取材：在人工流產(chǎn)術(shù)后，將無菌吸出的組織全部倒入無菌碗中，通過肉眼觀察分離出絨毛和蛻膜組織；再用無菌紗布吸去蛻膜組織的血液后，裝入含1%雙抗的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基/F12完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號(hào)：R10-092-CV)的無菌試管中，于1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)，進(jìn)行原代細(xì)胞分離及培養(yǎng)。整個(gè)取材過程遵循無菌操作原則。

1.3.2 DSC的分離：采用酶消化法結(jié)合梯度離心法的方法[3]進(jìn)行DSC分離純化。蛻膜組織經(jīng)過Ⅳ型膠原酶消化成單細(xì)胞后，先分別用不同規(guī)格網(wǎng)篩(100、200、400目)濾去其中體積較大的腺上皮細(xì)胞，然后用Percoll梯度離心法分離出不同密度的DSC和蛻膜免疫細(xì)胞，再根據(jù)兩種細(xì)胞的貼壁性不同，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)30 min后即得到純化的DSC，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.3 DSC的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：在預(yù)先放置有經(jīng)TC處理的細(xì)胞爬片的6孔板中，加入上述新鮮分離的DSC(2×106個(gè))，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞3次，2 min/次。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min后，再用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞3次，2 min/次。加入0.3%聚乙二醇辛基苯基醚0.2 mL以增加細(xì)胞膜通透性。加入3%過氧化氫1 mL，室溫孵育15 min，以去除其中內(nèi)源性過氧化物酶活性。加入1%胎牛血清1 mL封閉細(xì)胞15 min。去除封閉液后，加入抗人波形蛋白抗體(1 ∶100)、抗人角蛋白-7抗體(1 ∶100)，4℃孵育過夜。次日，依次加入即用型免疫組化超敏檢測(cè)試劑盒的生物素化的二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素化的生物素反應(yīng)試劑，37℃孵育20 min；滴加二氨基聯(lián)苯胺工作液，避光顯色。蘇木素輕度復(fù)染，自來水沖洗后脫水、透明，中性樹膠封片。在Olympus倒置顯微鏡下觀察，爬片中見黃褐色顆粒出現(xiàn)即為陽性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3.4 DSC的分組培養(yǎng)： 收集貼壁細(xì)胞重懸于杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基/F12完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL。正常妊娠婦女的DSC加入溶媒無水乙醇(對(duì)照組)，RSA患者的DSC分為等量的兩部分：一部分加入溶媒無水乙醇(RSA組)、另一部分加入以無水乙醇為溶媒、濃度為10-7mol/L的1,25-(OH)2D3(RSA+VD組)，均培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，分裝凍存于-80℃冰箱，備用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 IL-17、IL-23水平檢測(cè)：取細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)IL-17和IL-23水平，所有步驟均按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說明書完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DSC的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 新鮮分離的DSC呈圓形，在培養(yǎng)30 min后即可牢固地貼壁生長，24 h后細(xì)胞形態(tài)呈梭形或不規(guī)則形。DSC經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，波形蛋白陽性，角蛋白-7陰性(見圖1)，純度接近100%。重復(fù)5次結(jié)果均一致，經(jīng)此方法分離純化的DSC可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

波形蛋白陽性 角蛋白-7陰性圖1 人早孕DSC的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定(×200)

2.2 3組DSC中IL-17、IL-23水平 3組DSC分泌IL-17水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中RSA組DSC分泌IL-17水平高于對(duì)照組和RSA+VD組(均P<0.05)，見表1。由于DSC細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-23表達(dá)水平較低，3組均超過了試劑盒的檢測(cè)下限，因此未能比較各組DSC細(xì)胞分泌IL-23的變化。

表1 3組DSC分泌IL-17水平(x±s，pg/mL)

注：與RAS組比較，#P<0.05。

3 討 論

輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)是近年來RSA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，IL-23/IL-17炎癥軸通路是維持Th17活化和功能的關(guān)鍵通路。研究證實(shí)，IL-23可通過IL-23/IL-23受體/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3信號(hào)通路來促進(jìn)Th17的轉(zhuǎn)化[2]。因此，我們推測(cè)IL-23/IL-17軸可能是治療RSA的一個(gè)新靶點(diǎn)。目前研究已證實(shí)，維生素D能通過多種途徑抑制Th17的增殖、分化過程，減少IL-17的產(chǎn)生[3]。然而目前在國內(nèi)外的文獻(xiàn)中，尚無有關(guān)維生素D如何參與母-胎界面局部IL-17調(diào)節(jié)的研究報(bào)告。

目前關(guān)于妊娠期間細(xì)胞因子的研究，多數(shù)是母體外周血和母-胎界面各種淋巴細(xì)胞的研究，而針對(duì)DSC分泌細(xì)胞因子的研究還比較少。DSC是一群具有特殊功能的細(xì)胞，是構(gòu)成蛻膜組織的主要細(xì)胞成分，約占蛻膜細(xì)胞總數(shù)的75%。DSC不僅能分泌多種細(xì)胞成分，形成細(xì)胞外基質(zhì)，還能分泌多種細(xì)胞因子，同時(shí)可與蛻膜免疫細(xì)胞一起參與母-胎界面的免疫調(diào)節(jié)，在胚胎的圍著床期發(fā)揮重要作用[6]。人類早孕期DSC可以分泌IL-β、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子β等多種細(xì)胞因子，且研究表明流產(chǎn)者DSC分泌的IL-β、IL-17水平高于正常早孕者[7]。本研究也顯示，RSA患者的DSC分泌IL-17水平高于正常孕婦(P<0.05)。由此可見，DSC分泌IL-17水平升高，可能是導(dǎo)致RSA發(fā)病的重要機(jī)制。

維生素D具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，在女性生殖和妊娠過程中發(fā)揮重要作用。孕婦體內(nèi)維生素D含量異常與妊娠期糖尿病、子癇前期、早產(chǎn)等多種妊娠期免疫相關(guān)性疾病相關(guān)[8]。維生素D缺乏與流產(chǎn)的發(fā)生具有相關(guān)性，孕婦血清中維生素D濃度下降可增加早期自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[9]。本課題組前期研究表明，RSA患者蛻膜組織中1，25-二羥基維生素D濃度低于正常早孕者，25-二羥基維生素D水平與IL-23/IL-17炎癥軸因子有關(guān)，與RSA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[10]。這與 Hou等[4]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)RSA患者血漿中維生素D濃度下降，且RSA的發(fā)病與血漿中維生素D的濃度呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，無論是在外周循環(huán)還是母-胎界面局部，維生素D水平都與RSA發(fā)病有一定的相關(guān)性。然而維生素D是通過何種機(jī)制參與流產(chǎn)的發(fā)病，還需要進(jìn)一步探討。

2004年，Bubanovic[11]首次報(bào)告了維生素D可作為治療URSA的一種新型藥物。此后，維生素D與RSA等生殖失敗相關(guān)疾病的關(guān)系逐漸受到重視。維生素D不僅能作用于T細(xì)胞，對(duì)固有免疫細(xì)胞也有調(diào)節(jié)作用，補(bǔ)充維生素D可以通過免疫調(diào)節(jié)作用，降低自然殺傷細(xì)胞的毒性，這可能有利于妊娠的維持[12]。本研究結(jié)果顯示， RSA+VD組DSC分泌IL-17水平低于RSA組(P<0.05)，說明用維生素D干預(yù)，能使RSA患者DSC分泌的IL-17水平明顯下降，維生素D可能在DSC活性調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。

此外，有研究顯示，從確認(rèn)妊娠起，每天對(duì)URSA患者經(jīng)陰道補(bǔ)充400 IU維生素D，至孕20周時(shí)患者血清IL-23濃度僅為(18.4±3.78)pg/mL，流產(chǎn)率降低到12.8%，而給予安慰劑治療的URSA患者血清IL-23濃度則達(dá)到(23.16±4.74)pg/mL，流產(chǎn)率為34.2%[13]。由此可見，維生素D可以通過降低血清IL-23水平，改善RSA患者的妊娠結(jié)局。而在本研究中，由于DSC細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-23表達(dá)水平較低，3組均超出試劑盒的檢測(cè)下限，無法對(duì)3組患者IL-23進(jìn)行比較。這可能與DSC分泌IL-23水平較低有關(guān)，在未來的實(shí)驗(yàn)研究中，我們將選擇靈敏性更高的試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，RSA患者DSC分泌IL-17水平升高，這可能不利于胚胎著床；維生素D可以抑制DSC分泌IL-17，這或可改變子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的容受性，有利于免疫耐受和胚胎著床、發(fā)育。