徐俊達，張 涵，石敬依，蔡文君，羅 容#（.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 00069； .天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 3067）

枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck 的干燥幼果［1］，是傳統(tǒng)的“六陳”中藥之一。 所謂“陳藥”是指這些藥物陳久放置后入藥，藥效更佳或毒性更低。 南北朝梁代《本草經(jīng)集注》中記載6 味中藥需陳用，“凡狼毒、枳實、橘皮、半夏、麻黃、吳茱萸，皆欲得陳久者良，其余須精新也”，說明上述6 味藥通過陳化后更能滿足臨床用藥需要［2-3］。 此后，《新修本草》、李東垣《珍珠囊指掌補遺藥性賦》及張從正《儒門事親》等文獻中記載的陳藥均有枳實。

如何界定中藥陳化時限一直是陳藥研究中的一個難點。歷代本草或方書眾說不一，有1 年、2 年、3 年甚至數(shù)十年者，也有“陳年”“多年”“年久”和“陳久”等不能明確具體時間的說法；即使同一種藥物，陳化時間亦有不同［2］。 此外，枳實的陳久存放是否會對其已明確的除揮發(fā)油外的其他藥效組分產(chǎn)生實質(zhì)影響還未見報道。

枳實藥材主要含有揮發(fā)油類、黃酮類、生物堿類和香豆素類等成分［4-6］。 辛弗林是《中華人民共和國藥典》（2015 年版）中枳實的定量質(zhì)控成分，通常被認為是枳實的特征成分。 黃酮類化合物是枳實的主要有效成分［6-7］。 本研究結(jié)合本草論述和現(xiàn)代藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究結(jié)果，以酸橙枳實為研究對象，以辛弗林、新橙皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、川陳皮素、橙皮苷和蕓香柚皮苷含量為質(zhì)量評價指標，建立同時測定新橙皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、川陳皮素、橙皮苷和蕓香柚皮苷的超高效液相 色 譜 法（ ultra-high performance liquid chromatography，UPLC），初步比較不同貯存時間對枳實藥效組分的影響，以期為枳實陳用提供科學(xué)依據(jù)，為枳實陳化時限提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent-1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；WATERS ACQUITY UPC2 型超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；WG-43 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；YP601N 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；DFT-150 型手提式高速中藥粉碎機（上海左樂儀器有限公司）；KQ5200DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

對照品：辛弗林，批號110727-0036；新橙皮苷，批號111857-201102；柚皮苷標準物質(zhì)，批號110722-201312；野漆樹苷，批號111919-201102；橙皮苷，批號：110721-201014；酸橙枳實對照藥材，批號1120936-201005；以上對照品及對照藥材均購于中國食品藥品檢定研究院。 川陳皮素，批號MUST-13041206，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院和北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制；蕓香柚皮苷標準物質(zhì)，批號14259-46-2，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院生產(chǎn)。 色譜級乙腈（批號181005，F(xiàn)isher Chemical 公司）；色譜級甲醇（批號181102，F(xiàn)isher Chemical 公司）；乙酸（批號20150807，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；實驗用水為屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 枳實樣品

枳實藥材除7 號樣品外，均購于中藥材市場。 所有樣品均為新貨，見表1。 枳實藥材每年5—6 月產(chǎn)新，新貨進入市場一般為當(dāng)年6 月以后。 中藥材市場收集的樣品中，收集日期為上半年的均為前一年所產(chǎn)，收集日期為下半年的均為當(dāng)年所產(chǎn)。 7 號樣品為研究者于2016 年上半年收集于樟樹某實驗林場，為2016 年當(dāng)年所產(chǎn)。 所有樣品規(guī)格均為半球形，直徑為1～2 cm。 貯存條件為常溫（10 ～30 ℃），避光，密閉。 樣品由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院羅容博士鑒定及與酸橙枳實對照藥材進行薄層鑒別，所有樣品為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果。 樣品保存于首都醫(yī)科大學(xué)中藥資源與鑒定實驗室。

表1 酸橙枳實藥材信息表Tab 1 Information of immature fruit of citrus aurantium

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液：分別精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、新橙皮苷和川陳皮素對照品適量，置于5 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成各對照品儲備溶液，質(zhì)量濃度分別為1.132、2.536、1.064、3.162 及1.066 g／L。 精密稱取橙皮苷對照品適量，置于25 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.350 4 g／L 的對照品儲備溶液。 精密稱取辛弗林標準品適量，用水定容至5 ml，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.246 mg／ml 的對照品儲備溶液。

2.1.2 供試品溶液：取枳實藥材粉末0.5 g（過65 目篩），精密稱定，置圓底燒瓶中，加水10 ml，100 ℃水浴提取1 h，過濾，將2 次濾液合并至蒸發(fā)皿中，濃縮至約10 ml，轉(zhuǎn)移至25 ml 容量瓶中，水定容至25 ml，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件

（1）黃酮類化合物檢測色譜條件在參考文獻［8］的基礎(chǔ)上改進如下。 WATERS ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；VanGuard 預(yù)柱；流動相為水（A，含0.2%冰醋酸）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫條件為0～15 min，95%～80%A；15～25 min，80%～75%A；25～28 min，75%～60%A；28～35 min，60%～0%A）；檢測波長330 nm；柱溫30 ℃；流速0.3 ml／min；進樣量1 μl，自動進樣。 （2）辛弗林檢測色譜條件如下。Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為甲醇-水（V∶V＝1 ∶1），水相中含磷酸二氫鉀0.06%、十二烷基磺酸鈉0.1%和冰醋酸0.1%；檢測波長275 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 ml／min；進樣量10 μl，自動進樣。 酸橙枳實對照品及樣品的色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系及檢測限

將“2.1.1”項制得的樣品，分別稀釋至如下質(zhì)量濃度，依次自動進樣。 柚皮苷對照品儲備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.507、1.014、1.521、2.028 及2.536 g／L。 新橙皮苷對照品儲備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為1.054、1.581、2.108、2.635 及3.162 g／L。 橙皮苷對照品儲備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.116 8、0.175 2、0.233 6、0.292 0 及0.350 4 g／L。 蕓香柚皮苷對照品儲備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.056 6、0.113 2、0.169 8、0.226 4 及0.283 0 g／L。 川陳皮素對照品儲備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.010 66、0.021 32、0.031 98、0.042 64 及0.053 30 g／L。 野漆樹苷對照品儲備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.010 64、0.021 28、0.031 92、0.042 56 及0.053 20 g／L。 辛弗林對照品儲備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.017 35、0.034 71、0.052 06、0.069 41、0.086 77及0.104 10 g／L。 按“2.2”項下色譜條件，以進樣質(zhì)量濃度X（μg／ml）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線并計算檢測限（S／N≥3）及定量限（S／N≥10），結(jié)果見表2。

表2 標準曲線及定量限和檢測限結(jié)果Tab 2 Standard curve and quantitation and detection limit results

2.4 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，重復(fù)進樣6 次，測定峰面積以此計算RSD。 蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的RSD分別為0.71%、0.76%、1.11%、0.77%、0.91%、0.89%和0.46%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 和24 h 進樣，以蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的色譜峰峰面積計算RSD，分別為1.44%、0.76%、4.37%、1.93%、0.72%、0.60%和2.38%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗

稱取同一批枳實干燥粉末6 份，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件測定枳實中蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林含量的RSD分別為1.59%、1.77%、2.34%、2.73%、1.76%、2.27%和1.38%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收試驗

分別稱取枳實干燥粉末5 份，每份約0.25 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液。 吸取已知含量（含生藥10 mg／ml）的5 份枳實水提供試液1 ml，分別精密加入等同于藥材樣品含量的7 種對照品，用甲醇定容至10 ml，混勻，再按“2.2”項下色譜條件進行測定，進樣量為10 μl。 測定各成分的含量，計算蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的平均加樣回收率及RSD，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率測定結(jié)果（n＝5）Tab 3 Recovery rates of spiked samples （n＝5）

2.8 樣品含量測定

取10 個不同批次的枳實藥材粉末（過65 目篩）約0.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項操作方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行分析，計算蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的含量，結(jié)果見表4。

表4 不同貯存時間酸橙枳實藥材7 個成分的含量測定結(jié)果（±s，%，n＝3）Tab 4 Contents of seven ingredients in immature fruit of citrus aurantium samples with different storage time （±s，%， n＝3）

表4 不同貯存時間酸橙枳實藥材7 個成分的含量測定結(jié)果（±s，%，n＝3）Tab 4 Contents of seven ingredients in immature fruit of citrus aurantium samples with different storage time （±s，%， n＝3）

編號 蕓香柚皮苷 柚皮苷 野漆樹苷 橙皮苷 新橙皮苷 川陳皮素 辛弗林1 1.241 9±0.009 3 9.176 0±0.003 5 0.074 9±0.000 2 0.758 0±0.001 8 6.800 0±0.001 4 0.119 7±0.000 4 0.340 8±0.000 3 1.084 4±0.014 8 9.615 8±0.006 9 0.099 7±0.000 4 0.780 5±0.001 8 9.213 2±0.005 5 0.119 7±0.000 1 0.339 7±0.000 3 3 0.796 6±0.003 8 6.795 5±0.010 4 0.075 9±0.000 3 0.703 8±0.002 2 5.921 8±0.004 3 0.119 6±0.000 2 0.355 3±0.000 9 4 0.656 0±0.001 1 6.649 9±0.001 9 0.072 0±0.000 4 0.870 1±0.003 2 9.033 9±0.002 9 0.042 4±0.000 1 0.151 1±0.000 7 5 1.005 8±0.007 7 7.632 6±0.018 6 0.097 4±0.000 4 0.713 5±0.002 5 7.182 3±0.002 0 0.130 6±0.000 3 0.291 1±0.000 6 6 0.716 7±0.006 9 8.013 6±0.014 5 0.074 3±0.000 2 0.673 0±0.001 6 9.013 5±0.002 3 0.067 6±0.000 1 0.315 7±0.000 6 7 0.426 5±0.000 7 6.889 4±0.004 6 0.064 9±0.000 3 0.859 6±0.002 8 13.878 7±0.008 0 0.058 7±0.000 1 0.246 0±0.000 7 8 1.152 5±0.011 0 5.970 2±0.015 7 0.093 7±0.000 5 0.920 6±0.001 8 9.089 6±0.004 1 0.097 3±0.000 3 0.337 7±0.000 6 9 0.633 8±0.000 4 0.173 4±0.000 4 0.019 7±0.000 3 0.557 0±0.000 9 0.150 8±0.000 4 0.080 1±0.000 1 0.344 6±0.000 5 10 1.070 1±0.007 7 4.293 4±0.005 9 0.057 7±0.000 2 1.150 2±0.004 8 11.336 0±0.006 4 0.095 0±0.000 4 0.468 4±0.000 2 2

2.9 不同貯藏時間和藥效組分含量之間的關(guān)系

以貯藏時間為橫坐標，藥效組分含量為縱坐標做曲線圖，見圖2。 其中，貯存時間為6 年、4 年以及3 年對應(yīng)的縱坐標為2 號和3 號、5 號和6 號、7 號和8 號樣品中各成分含量的平均值。 比較不同貯藏時間的酸橙枳實中藥效組分蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的含量隨貯存時間的變化趨勢。 枳實中辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷及川陳皮素含量與貯存時間未呈現(xiàn)出遞減或遞增規(guī)律。 相同貯存時間的樣品中藥效組分的含量差異大于不同貯存時間的樣品，樣品的其他信息對于所測藥效組分的影響可能大于貯藏時間。 蕓香柚皮苷與橙皮苷含量波動與貯存時間關(guān)系不大。 野漆樹苷與川陳皮素在枳實中含量較低，隨時間變化其含量變化幅度較小。 除了貯存時間為2 年的9 號樣品，其他樣品隨貯存時間延長柚皮苷含量有升高趨勢，新橙皮苷含量有降低趨勢。 辛弗林含量與貯存時間之間無明顯規(guī)律性。

圖2 酸橙枳實不同貯藏時間與其內(nèi)部各成分含量變化曲線圖Fig 2 Variation curve of different storage time and the contents of immature fruit of citrus aurantium

3 討論

3.1 關(guān)于研究樣品

樣品均為來源于酸橙的藥材枳實，規(guī)格均選擇了半球形，直徑為1～2 cm，排除了品種和規(guī)格的干擾，但未能完全排除產(chǎn)地、采收時間等其他因素的影響。 研究不同貯存時間對枳實質(zhì)量的影響，理想的樣品是同一批樣品在不同貯存年限時分別進行藥效組分的含量測定，并對數(shù)據(jù)進行比對分析。 本研究是選擇不同貯存時間的不同樣品進行研究。 不同貯存時間的樣品為市場隨機抽取的樣品，但樣本量有限，未能做到同一貯存時間的多樣本重復(fù)研究。 針對研究中涉及的10 份樣品，在貯存7 年以內(nèi)的時限中，其辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷及川陳皮素含量與貯存時間未呈現(xiàn)出遞減或遞增規(guī)律。

貯存時間為2 年的9 號樣品中，柚皮苷、新橙皮苷含量與貯存時間相鄰的1 年和3 年樣品相比分別相差近20 ～30 倍、60～70 倍。 推測與該樣品其他信息有關(guān)，與貯存時間無關(guān)。 故在做柚皮苷、新橙皮苷與貯藏時間相關(guān)趨勢分析時，剔除了該樣品。 但進一步的藥效組分含量與貯藏時間的相關(guān)性分析還需更多的樣品研究支撐。

3.2 陳藥用藥及陳化時限的科學(xué)依據(jù)

陳藥的使用是中醫(yī)用藥的特色之一。 但對于陳藥用藥的科學(xué)依據(jù)，除陳皮外，其他陳藥陳用機制相關(guān)研究較為薄弱。 直接針對枳實陳用機制的研究報道不多。 根據(jù)目前對枳實化學(xué)成分的研究成果，結(jié)合陳皮陳用的機制研究結(jié)果［9-15］，推斷枳實陳用的機制可能是隨著貯存時間的延長其揮發(fā)油的含量降低，從而使其對胃腸道刺激的副作用降低。 在樣本量有限的前提下，本研究的數(shù)據(jù)依然提示，不同貯存時間的枳實樣品，其辛弗林和黃酮類藥效組分含量有所不同，有的波動范圍較大。 其中，柚皮苷和新橙皮苷含量與貯存時間有一定關(guān)聯(lián)趨勢可循。 從前期眾多文獻報道中［16-20］可知，本研究中所用樣品測量出的藥效組分含量波動并不大于文獻報道中產(chǎn)地、采收時間及品種等因素造成的含量波動。 7 年內(nèi)不同貯存時間，酸橙枳實藥材質(zhì)量未見明顯差異，可作為枳實“陳久者良”的科學(xué)依據(jù)之一。 隨著枳實貯存時間的繼續(xù)延長，是否會對枳實的辛弗林和黃酮類藥效組分產(chǎn)生影響，還需要進一步追蹤，枳實的陳化時限還未能確定。 揮發(fā)油也是枳實的有效成分，并且揮發(fā)油含量與貯存時間的相關(guān)性較強。 枳實揮發(fā)油的含量與貯存時間的變化規(guī)律還需進一步研究，同時輔以藥效組分與功效的量效關(guān)系研究，有望為枳實陳用及陳化時限提供更多的科學(xué)支撐。

3.3 辛弗林含量

影響枳實藥材生物堿含量的因素主要有品種、產(chǎn)地、規(guī)格、采收時間和貯存時間等［16-20］。 4 號、5 號和7 號樣品中辛弗林的含量未達到《中華人民共和國藥典》（2015 年版）要求的最低限度0.30%。 5 號和6 號樣品貯存時間均為7 年，產(chǎn)地均為江西，6號樣品辛弗林含量符合標準；7 號和8 號樣品貯存時間均為3年，8 號樣品辛弗林含量符合標準。 推測辛弗林含量未合格與其貯存時間、品種和規(guī)格關(guān)系不大，可能與樣品其他因素有關(guān)。

3.4 含量測定方法

本研究同時建立了UPLC 法測定枳實中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷及川陳皮素6 種黃酮類成分的含量測定方法。 《中華人民共和國藥典》（2015 年版）枳實辛弗林含量測定方法中，對枳實樣品的處理步驟較復(fù)雜，本研究中簡化了樣品處理方法。 通過方法學(xué)考查，所建立的方法可行，可為定量評價枳實質(zhì)量提供參考。