李世娟 王延龍 齊偉杰
摘 要:建立了食品中10種合成色素(檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、酸性紅、赤蘚紅與酸性橙Ⅱ)的高效液相色譜法。本法定量檢出限為:0.4~0.6 mg/kg,10種色素在1~20 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均高于0.999,加標(biāo)回收率為88.4%~96.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%~5.24%。本方法檢測(cè)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng),非常適用于樣品數(shù)量大、檢測(cè)項(xiàng)目多的食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)。
關(guān)鍵詞:HPLC-DAD;合成色素;食品
目前,檢測(cè)合成色素的國(guó)標(biāo)方法有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、微柱色譜法等,但大多數(shù)方法僅能同時(shí)檢測(cè)少數(shù)幾種色素。因此,針對(duì)基層食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室人員少,樣品種類多,檢測(cè)項(xiàng)目復(fù)雜,工作量大的現(xiàn)狀,研究出了能同時(shí)檢測(cè)食品中的10種常見(jiàn)人工合成色素的方法,能夠大大縮減檢測(cè)周期、減低檢測(cè)成本、提高檢測(cè)效率。
1 材料與方法
1.1 儀器與設(shè)備
液相色譜儀U-3000配DAD檢測(cè)器(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);C18色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm,Diamonsil Plus公司);KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TGL-20M低溫離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)。
1.2 試劑
甲醇(色譜純),乙酸銨(色譜純),屈臣氏超純水。
石油醚、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、氨水、乙醇均為分析純。
乙酸銨溶液(10 mmol/L):0.77 g乙酸銨加水溶解定容至1 000 mL,并超聲10 min。
乙醇-氨溶液: 取1 mL氨水,加入到100 mL 70%乙醇中。
亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L):稱取106 g亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O]加水至1 000 mL。
乙酸鋅溶液(220 g/L):稱取220 g乙酸鋅[Zn(CH3COO)2·2H2O]溶于少量水中,加入30 mL冰乙酸,加水稀釋至1 000 mL。
1.3 樣品處理
稱取2.0 g粉碎后的樣品于15 mL離心管,加入8 mL乙醇-氨溶液,渦旋均勻后超聲提取10 min,加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1.0 mL,混勻后于5 000 r/min離心5 min,取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜,上機(jī)。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線
將濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL與20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行液相分析,以峰面積與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度進(jìn)行線性回歸分析。
2 結(jié)果與討論
2.1 色譜條件的優(yōu)化
2.1.1 流動(dòng)相的確定
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),水相中乙酸銨的濃度在10~20 mmol/L范圍內(nèi)時(shí),各組分均有較好的分離效果,但在梯度洗脫條件下,高濃度的乙酸銨流動(dòng)相在有機(jī)相比例波動(dòng)較大的情況下混合析出結(jié)晶,從而降低色譜柱的使用壽命,因此,水相中乙酸銨的濃度設(shè)定為10 mmol/L。
2.1.2 柱溫的確定
考察了柱溫為25、30、35 ℃和40 ℃時(shí)各組分的分離效果,發(fā)現(xiàn)柱溫在此范圍內(nèi)均能有效分離,隨著溫度的升高,出峰時(shí)間略微縮短,但柱溫為30 ℃時(shí)各組分的峰形尖銳且分離度較好,因此選擇柱溫為 35 ℃。
2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定
使用DAD檢測(cè)器對(duì)各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液在210~600 nm下進(jìn)行光譜掃描,測(cè)得各組分最佳吸收波長(zhǎng)分別為檸檬黃428 nm、新紅523 nm、莧菜紅534 nm、胭脂紅513 nm、日落黃494 nm、誘惑紅509 nm、亮藍(lán)595 nm、酸性紅512 nm、赤蘚紅529 nm以及酸性橙492 nm。再根據(jù)各組分出峰順序,發(fā)現(xiàn)部分組分在可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)的最佳吸收波長(zhǎng)范圍有重合,經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化,設(shè)定出可見(jiàn)紫外檢測(cè)程序。見(jiàn)表1。
2.1.4 色譜圖
通過(guò)高效液相色譜分離,二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè),優(yōu)化色譜條件后10種人工合成色素得到有效分離,10種合成色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示,樣品在400~600 nm波長(zhǎng)下無(wú)明顯雜質(zhì)干擾。
2.2 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化
2.2.1 提取液的選擇
分別用去離子水,1%氨水和乙醇-氨溶液提取樣品,發(fā)現(xiàn)去離子水和1%氨水對(duì)赤蘚紅和酸性橙Ⅱ的提取率偏低,乙醇-氨溶液能用有效提取所有色素,同時(shí)具有一定的沉淀蛋白的作用。
2.2.2 沉淀劑的優(yōu)化
分別用0.5、1.0、1.5 mL與2.0 mL沉淀劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),1.0 mL沉淀劑能夠有效去除樣品中蛋白,沉淀劑過(guò)多會(huì)使色素的回收率降低。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和檢測(cè)限
對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣分析,以溶液濃度為橫坐標(biāo),以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。
3倍信噪比時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度為出檢出限。
2.4 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)
分別稱取空白樣和加標(biāo)樣各2份,其中2份加標(biāo)樣分別加入100 μL濃度為1 mg/L的10種色素混標(biāo)溶液,按照1.3進(jìn)行處理后上機(jī)檢測(cè),結(jié)果取平均值,計(jì)算回收率。對(duì)其中一份加標(biāo)樣平行檢測(cè)6次,計(jì)算RSD值,相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表3。
3 小結(jié)
本方法簡(jiǎn)化了前處理步驟,不需要再進(jìn)行固相萃取和濃縮步驟,大大縮短了前處理時(shí)間。采用絕大部分干擾物無(wú)響應(yīng)的400~600 nm的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè),避免大部分食品添加劑和天然色素的干擾。結(jié)果表明,該方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、定量結(jié)果可靠,非常適合同時(shí)處理多批次樣品。