古長(zhǎng)維，劉仲，武苗苗，辛紅娟，黨曉燕

腦卒中是由于腦血流減少或供氧不足導(dǎo)致腦組織死亡的急性腦血管疾病，可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中指動(dòng)脈粥樣硬化或血栓阻塞血管致使腦部血液供應(yīng)中斷；出血性腦卒中指血管破裂致使血液滲入大腦，進(jìn)而破壞腦組織［1］。腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率及高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)［2-3］，其中缺血性腦卒中發(fā)病率約占腦卒中患病人數(shù)的60%～70%。目前臨床上關(guān)于腦卒中尚缺乏有效的治療方法，常以預(yù)防為主［4］。廣藿香提取物廣藿香酮（POG）具有抗癌、抗炎、抗菌等多重藥理作用［5-6］，常用于心血管疾病、糖尿病、肝炎等多種疾病的預(yù)防［7］，且其在前列腺癌、白血病和膽囊癌等惡性腫瘤中具有明顯的抗腫瘤作用［8-10］。相關(guān)研究表明，POG可通過(guò)抑制機(jī)體Livin蛋白表達(dá)、激活B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）而促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而活化半胱氨酸天冬酶3（caspase-3），導(dǎo)致DU145細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡基因如Bcl-2、caspase-3等與高血壓密切相關(guān)［11］。既往關(guān)于POG治療腦卒中的報(bào)道較少。本研究旨在探討POG對(duì)腦卒中大鼠的影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)于2018年12月—2019年4月完成。選取7～8周齡SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質(zhì)量150～170 g，由西安交通大學(xué)動(dòng)物研究中心提供（許可證號(hào)：SCXK新2018-0076）。大鼠均在西安交通大學(xué)動(dòng)物房SPF級(jí)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動(dòng)物房溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，人工光照、陰暗各12 h，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠均可自由進(jìn)食和飲水。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

1.2.1 主要藥物 POG（四川省維克奇生物科技有限公司生產(chǎn)，CAS號(hào)：23800-56-8，純度≥98%），水合氯醛（成都德思特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。

1.2.2 主要試劑 超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（上海一研生物科技有限公司生產(chǎn)），丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司生產(chǎn)），一氧化氮（NO）試劑盒（上海嵐派生物科技有限公司生產(chǎn)），聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠配制試劑盒（西安赫特生物科技有限公司生產(chǎn)），TRIzol試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)），Rabbit anti-Bcl-2（Sino Biolgical），Rabbit anti-VEGF（Sino Biolgical），Rabbit anti-Bax（Sino Biolgical），Rabbit anti-GAPDH（Sino Biolgical），LY294002（德國(guó)達(dá)姆施塔特默克公司生產(chǎn)），反轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒（Thermo Fisher Scientific生產(chǎn)）。

1.2.3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡（上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)），高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific生產(chǎn)），低溫離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)），微量分光光度儀（梅特勒-托利多國(guó)際有限公司生產(chǎn)），化學(xué)發(fā)光儀（Bio-Rad公司生產(chǎn)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模 采用線栓法阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈血流以制備腦卒中模型，具體方法如下：大鼠經(jīng)10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉后仰臥固定于平板上，給予碘伏消毒，于大鼠頸部正中做一切口，而后分離頸部右側(cè)皮下組織和腺體，沿右側(cè)胸鎖乳突肌腱向下探尋頸動(dòng)脈并對(duì)頸總動(dòng)脈近端、遠(yuǎn)端頸外動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎，在其頸總動(dòng)脈分叉部或頸外動(dòng)脈殘端插入直徑為0.26 mm的魚(yú)線并以插入約18 mm直至有阻塞感為宜，再采用血管夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈近端；最后在頸部切口縫合前結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處，固定閉合線［12］。大鼠禁食12 h。

1.3.2 分組 將36只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（未經(jīng)模型誘導(dǎo)，n=6）、對(duì)照組（建模后未經(jīng)治療，n=6）、低劑量組（建模24 h后給予POG 5 mg/kg，n=6）、中劑量組（建模24 h后給予POG 15 mg/kg，n=6）、高劑量組（建模24 h后給予POG 45 mg/kg，n=6）和LY294002組（建模24 h后給予0.1%～0.3%二甲亞砜溶解至濃度為0.1%，n=6）。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化AKT（p-AKT）、磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白相對(duì)表達(dá)量 采用Western blot法檢測(cè)六組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量，具體操作如下：按照SDSPAGE凝膠配制試劑盒說(shuō)明書(shū)配置凝膠，確保六組大鼠蛋白樣量相同；根據(jù)marker標(biāo)志切割目的蛋白所在區(qū)域凝膠，將濃縮膠轉(zhuǎn)固相載體如聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后孵育p-PI3K、p-AKT、p-eNOS第一抗體并置于4 ℃冰箱中過(guò)夜，次日孵育第二抗體1 h，再次洗膜并將PVDF膜置入化學(xué)發(fā)光儀的暗盒中顯示蛋白條帶，以目的基因蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參基因GAPDH的灰度值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量 分別采用Westren blot法、RT-qPCR方法檢測(cè)Bcl-2、Bax、VEGF蛋白、mRNA相對(duì)表達(dá)量，Westren blot法具體操作與上述一致，RT-qPCR方法具體如下：首先，按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大鼠組織總RNA并采用2-ΔΔCq方法進(jìn)行定量；其次，按照RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配置25 μl的反應(yīng)體系（包括10 μl Total RNA，2.5 μl 10×DNaseI Buffer，20 U RNase Inhibitor，1 μl RNase-free，11 μl DEPC處理水）將RNA合成cDNA，取cDNA；再配置25 μl的總PCR反應(yīng)體系（包括 17.5 μl ddH2O，2.5 10×buffer，2 μl dNTP，0.2 μl Taq DNA聚 合 酶，1 μl Forward primer，1 μl Reverse primer）擴(kuò)增cDNA，按照95 ℃初始變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s的程序反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，根據(jù)循環(huán)閾值計(jì)算Bcl-2、Bax、VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。

1.4.3 SOD、MDA、NO水平 分別采用SOD試劑盒、MDA ELISA試劑盒、NO試劑盒檢測(cè)六組大鼠大腦皮質(zhì)和外周血SOD、MDA及NO水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

表1 Bcl-2、Bax、VEGF引物序列Table 1 Primer sequences of Bcl-2，Bax and VEGF

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0（International Business Machines Corporation，IBM）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量 六組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中高劑量組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，p-AKT和p-eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量高于LY294002組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 六組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s，μg/ml）Table 2 Comparison of relative protein expression quantity of p-PI3K，p-AKT and p-eNOS in the six groups

表2 六組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s，μg/ml）Table 2 Comparison of relative protein expression quantity of p-PI3K，p-AKT and p-eNOS in the six groups

注：p-PI3K=磷酸化PI3K，AKT=磷酸化AKT，p-eNOS=磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與高劑量組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) p-P13K p-AKT p-eNOS空白對(duì)照組 6 0.19±0.01 0.20±0.01 0.18±0.01對(duì)照組 6 0.79±0.02 0.77±0.02 0.71±0.03低劑量組 6 0.57±0.01 0.59±0.01 0.59±0.01中劑量組 6 0.54±0.01 0.49±0.01 0.39±0.01高劑量組 6 0.36±0.02a 0.38±0.02a 0.38±0.02a LY294002 組 6 0.39±0.02 0.27±0.01b 0.23±0.01b F值 4.03 3.23 4.68 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 Bcl-2、Bax、VEGF蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量六組大鼠Bcl-2、Bax、VEGF蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中高劑量組大鼠Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，Bax、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組大鼠Bcl-2、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3）。

2.3 大腦皮質(zhì)和外周血NO、MDA、SOD水平 六組大鼠大腦皮質(zhì)和外周血NO、MDA、SOD水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)和外周血NO、SOD水平高于對(duì)照組，大腦皮質(zhì)和外周血MDA水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)和外周血MDA水平高于LY294002組，大腦皮質(zhì)和外周血SOD水平低于LY294002組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表4）。

3 討論

PI3K是一種由趨化因子受體激活的信號(hào)傳導(dǎo)酶［13］。既往研究表明，PI3K能與C5a受體結(jié)合形成激動(dòng)劑而激活多種信號(hào)蛋白［14］。PI3K抑制劑蟲(chóng)草素與LY294002均可抑制趨化劑誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的趨化性［15-16］，其中PI3K活化主要與靠近其質(zhì)膜內(nèi)側(cè)底物有關(guān)。多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、VEGF、人生長(zhǎng)因子（HGF）、血管生成素1（Ang1）和胰島素等均能激活PI3K，也可通過(guò)激活受體酪氨酸激酶（RTK）引起自磷酸化［17］。PI3K激活導(dǎo)致第二信使質(zhì)膜內(nèi)磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）產(chǎn)生，該蛋白可與信號(hào)蛋白AKT和磷酸肌醇依賴激酶1（PDK-1）結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)AKT中Ser308磷酸化，激活A(yù)KT［18］。AKT激活I(lǐng)κB激酶（IKKα）可降解NF-κB的抑制劑IκB，從而使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來(lái)進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，通過(guò)激活其靶基因而提高細(xì)胞存活率［19］。本研究結(jié)果顯示，高劑量組大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，p-AKT和p-eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量高于LY294002組，提示POG、LY294002均可使腦卒中大鼠PI3K/AKT信號(hào)通路受到抑制，究其原因可能為高劑量POG的作用方式與LY294002相似，均可抑制PI3K、AKT磷酸化。

表3 六組大鼠Bcl-2、Bax、VEGF蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s，μg/ml）Table 3 Comparison of relative protein and mRNA expression quantity of Bcl-2，Bax and VEGF in the six groups

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) 蛋白相對(duì)表達(dá)量 mRNA相對(duì)表達(dá)量Bcl-2 Bax VEGF Bcl-2 Bax VEGF空白對(duì)照組 6 0.40±0.01 0.08±0.02 0.07±0.01 0.036±0.001 0.001±0.000 0.017±0.003對(duì)照組 6 0.01±0.01 0.80±0.01 0.36±0.02 0.005±0.002 0.004±0.001 0.003±0.001低劑量組 6 0.11±0.02 0.69±0.02 0.34±0.01 0.006±0.002 0.003±0.001 0.004±0.001中劑量組 6 0.18±0.01 0.20±0.01 0.28±0.02 0.012±0.001 0.002±0.001 0.006±0.001高劑量組 6 0.25±0.01a 0.17±0.02a 0.19±0.01a 0.017±0.002a 0.002±0.001a 0.012±0.001a LY294002 組 6 0.28±0.02a 0.18±0.01a 0.07±0.01a 0.027±0.002a 0.002±0.001a 0.016±0.001a F值 3.06 2.76 2.94 3.19 2.26 4.15 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表4 六組大鼠大腦皮質(zhì)和外周血NO、MDA和SOD水平比較（±s）Table 4 Comparison of NO，MDA and SOD in cerebral cortex and peripheral blood in the six groups

表4 六組大鼠大腦皮質(zhì)和外周血NO、MDA和SOD水平比較（±s）Table 4 Comparison of NO，MDA and SOD in cerebral cortex and peripheral blood in the six groups

注：NO=一氧化氮，MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與高劑量組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) NO（μmol/g） MDA（nmol/ml） SOD（U/mg）大腦皮質(zhì) 外周血 大腦皮質(zhì) 外周血 大腦皮質(zhì) 外周血空白對(duì)照組 6 7.13±0.04 13.32±3.61 4.97±0.01 11.82±2.28 136.51±16.31 160.31±32.85對(duì)照組 6 0.83±0.01 3.49±0.05 13.25±4.32 19.45±3.16 68.61±13.92 50.64±3.6低劑量組 6 0.84±0.01 3.65±0.04 9.28±2.12 19.19±2.76 69.37±12.83 46.72±5.93中劑量組 6 4.16±0.01 6.16±0.03 7.35±3.28 16.08±1.92 90.58±20.06 69.32±3.86高劑量組 6 4.95±0.01a 8.34±0.04a 5.09±1.54a 14.11±4.38a 116.82±40.31a 92.34±31.30a LY294002 組 6 5.18±0.01 10.25±0.02 4.99±0.59b 10.37±2.06b 126.28±5.27b 127.29±2.14b F值 3.54 4.39 4.28 5.36 10.54 12.82 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，是檢測(cè)細(xì)胞氧化損傷的重要指標(biāo)，可反映自由基對(duì)組織和細(xì)胞的損傷程度；SOD是一種內(nèi)源性抗氧化酶，可抑制活性氧簇（ROS）產(chǎn)生，可反映機(jī)體清除氧自由基的能力。既往研究表明，ROS在腦卒中所致腦組織損傷中具有重要作用。缺血再灌注組織中產(chǎn)生的ROS可被代謝為前列腺素和白三烯，導(dǎo)致白細(xì)胞趨化并控制血管內(nèi)皮細(xì)胞功能［20］。本研究結(jié)果顯示，高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)和外周血SOD水平高于對(duì)照組、LY294002組，大腦皮質(zhì)和外周血MDA水平低于對(duì)照組、LY294002組，提示大劑量POG對(duì)腦卒中大鼠腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化有保護(hù)作用。

NO是由一氧化氮合酶（NOS）催化L精氨酸（L-Arg）末端胍基氮氧化而成［21］。NO與心血管、神經(jīng)、胃、腎和肝臟疾病密切相關(guān)［22］，其是一種新的免疫分子和炎性遞質(zhì)，可介導(dǎo)內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）等細(xì)胞因子。eNOS既可產(chǎn)生NO擴(kuò)張血管，還可產(chǎn)生超氧化物收縮血管。既往研究表明，谷胱甘肽化修飾參與氧化應(yīng)激過(guò)程，是eNOS氧化還原的開(kāi)關(guān)［23］。相關(guān)研究表明，高血壓患者血管NO增多，與血管擴(kuò)張功能受損有關(guān)［24］。這種氧化應(yīng)激也同時(shí)發(fā)生在心臟病發(fā)作、腦卒中、糖尿病和癌癥中，提示為恢復(fù)NOS的正常功能而對(duì)這種氧化還原開(kāi)關(guān)進(jìn)行復(fù)位可能是一種潛在的治療方法。本研究結(jié)果顯示，高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)和外周血NO水平高于對(duì)照組，提示高劑量POG可減輕腦卒中大鼠腦組織損傷。本研究結(jié)果還顯示，低、中、高劑量組各指標(biāo)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明腦卒中大鼠對(duì)POG無(wú)劑量依賴性。

綜上所述，POG可通過(guò)抑制PI3K/AKT-eNOS信號(hào)通路及脂質(zhì)過(guò)氧化而減輕腦卒中大鼠腦組織損傷，具有抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)血管等作用，且無(wú)劑量依賴性；但本研究納入樣本量有限，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，后期仍需擴(kuò)大樣本量繼續(xù)深入研究。

作者貢獻(xiàn)：古長(zhǎng)維進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，撰寫(xiě)淪為；劉仲、武苗苗進(jìn)行研究的實(shí)施及可行性分析；辛紅娟進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；黨曉燕進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；劉仲、武苗苗、辛紅娟負(fù)責(zé)論文的修訂。

本文無(wú)利益沖突。