張華 ，馬濤 ，李麗 ，黃健

(1.安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.水污染控制與廢水資源化安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601)

0 引言

污水生物除磷工藝中，聚磷菌通過厭氧環(huán)境下釋磷，好氧環(huán)境下過量吸磷將水中的磷元素轉(zhuǎn)移至聚磷菌胞內(nèi)，最終以排除剩余污泥的形式實(shí)現(xiàn)磷的去除。因此，聚磷菌在混合菌中所占比例高低直接決定著生物除磷的效果[1]。目前通常采用厭氧/好氧交替運(yùn)行法實(shí)現(xiàn)對(duì)污水生物除磷工藝中聚磷菌的富集，然而混合菌中高效聚磷菌的比例有待提高[2]。而采用傳統(tǒng)平板篩選法進(jìn)行聚磷菌篩選時(shí)工作量大，效率低，且針對(duì)性較差[3-4]。因此，高效聚磷菌的快速篩選和準(zhǔn)確鑒定有助于提高生物除磷的效率，有利于聚磷菌除磷機(jī)理和生理特性的深入研究[5]。

該試驗(yàn)采用序批式活性污泥反應(yīng)器首先富集聚磷菌，再采用厭氧/好氧交替平板迭代培養(yǎng)法初步粗篩聚磷菌菌株，并根據(jù)聚磷菌能夠利用代謝產(chǎn)生的半乳糖甘酶分解5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)產(chǎn)生藍(lán)綠色 5-溴-4-氯靛蘭的功能[6]，采用BCIP藍(lán)白斑篩選法快速分離聚磷菌。再將分離后的聚磷菌采用厭氧PHB染色法及好氧異染顆粒染色法進(jìn)一步進(jìn)行判斷，最后通過高通量測(cè)序技術(shù)鑒定其類別。該研究為生物除磷過程中高效聚磷菌的篩選和鑒定及聚磷菌生理特性及功能的深入研究提供基礎(chǔ)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)裝置和運(yùn)行周期

該試驗(yàn)采用序批式活性污泥反應(yīng)器對(duì)聚磷菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，反應(yīng)器容積為15 L，反應(yīng)器運(yùn)行每天4個(gè)周期，進(jìn)水30 min，厭氧60 min，好氧180 min，沉淀45 min，排水10 min后靜置35 min。每周期進(jìn)水和出水量均為4.5 L，各周期進(jìn)水，攪拌，反應(yīng)，出水等操作均采用微電腦時(shí)控開關(guān)進(jìn)行自動(dòng)啟停控制。

1.2 接種污泥和試驗(yàn)用水

該試驗(yàn)接種污泥取自合肥市某污水處理廠氧化溝。進(jìn)水采用人工配水，其中COD濃度為180.4 mg/L，正磷酸鹽濃度為12.3 mg/L，總氮濃度為8.3 mg/L。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分析檢測(cè)方法

正磷酸鹽檢測(cè)采用分光光度法，COD檢測(cè)采用重鉻酸鉀法，總氮檢測(cè)采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法。PHB染色法運(yùn)用蘇丹黑等染色液對(duì)厭氧階段PHB進(jìn)行染色，異染顆粒染色法運(yùn)用甲苯胺藍(lán)和孔雀綠等混合溶液對(duì)好氧階段異染顆粒進(jìn)行染色[7-8]。

1.3.2 聚磷菌的篩選

序批式活性污泥反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行后，用150 mL無菌錐形瓶取好氧末端的活性污泥，加入適當(dāng)玻璃珠震蕩破碎后逐級(jí)稀釋倍數(shù)為 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的5種不同濃度梯度的菌懸液。將厭氧固體培養(yǎng)基[9]于 121℃滅菌20 min，冷卻到 55～60℃后倒入培養(yǎng)皿，冷卻待用。將制備的菌懸液吸取400 μL涂布于厭氧培養(yǎng)基上，37℃于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用接種針挑取的方法把在厭氧培養(yǎng)基中生長迅速的菌落接種至好氧固體培養(yǎng)基[10]上，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h。待菌落長好后采用相同方法接種至厭氧培養(yǎng)基中，重復(fù)6～7次。挑取生長迅速的菌落接種于涂布100 μL的BCIP顯色劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)，將生長迅速的藍(lán)綠色菌落作為研究對(duì)象，最終將厭氧階段的菌種進(jìn)行PHB染色，好氧階段進(jìn)行異染顆粒染色，在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化和保存。

1.3.3 菌株除磷性能測(cè)試

取用LB培養(yǎng)基保存的冷藏菌種，吸取該菌種混合液20 μL到LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行劃線涂布，在37℃好氧培養(yǎng)24 h后，用接種針挑取單菌落與0.3 mL無菌水混勻后，取100 μL混合液用涂布棒涂布接種于LB固體培養(yǎng)基的平板上，在37℃條件下培養(yǎng)24 h后，用孔徑為0.5 cm的打孔器取2個(gè)孔的菌種(包括培養(yǎng)基)到含15 mL LB液體培養(yǎng)基的無菌離心管中，于37℃、130 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h后作為種子液。再將種子液接入到含有100 mL配水液體培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中(種子液體積/合成污水液體培養(yǎng)基體積比為8%)，再放到溫度為37℃，轉(zhuǎn)速是120 r/min的搖床中培養(yǎng)18 h，使得錐形瓶中含有一定的菌種數(shù)量。再經(jīng)厭氧搖床培養(yǎng)0.5 h，使菌種這個(gè)階段充分吸收小分子有機(jī)物并釋放磷，再次開啟搖床曝氣培養(yǎng)1 h后，取懸濁液于離心管中，12000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液進(jìn)行磷指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.4 菌株生物學(xué)鑒定

將菌株委托通用生物(安徽)有限公司進(jìn)行16S rDNA穩(wěn)定區(qū)測(cè)序，在BCBI Genbank中使用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析，最后采用MEGA10.0軟件中的最大似然估計(jì)法構(gòu)建樣本菌株與相似菌株系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定出各菌株的菌屬。

2 結(jié)果與討論

2.1 序批式活性污泥反應(yīng)器工藝除磷效果分析

序批式活性污泥反應(yīng)器運(yùn)行結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定后，當(dāng)進(jìn)水磷濃度約為12.3 mg/L時(shí)，出水中磷約為0.2 mg/L，除磷率在95%以上，說明通過序批式活性污泥反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了聚磷菌的富集。

圖1 序批式活性污泥反應(yīng)器運(yùn)行結(jié)果

2.2 聚磷菌BCIP藍(lán)白斑篩選及染色分析結(jié)果

采用BCIP藍(lán)白斑篩選法對(duì)厭氧/好氧反復(fù)交替培養(yǎng)后的菌株進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，經(jīng)過BCIP藍(lán)白斑篩選后，共得到4株能夠分解BCIP呈現(xiàn)藍(lán)綠色的聚磷菌。

圖2 BCIP藍(lán)白斑篩選結(jié)果

對(duì)厭氧階段PHB和好氧階段異染顆粒進(jìn)行染色，結(jié)果如圖3所示。染色圖片均在100倍的OLYMPUS BX51電子顯微鏡下實(shí)現(xiàn)。由圖3可知，將4株菌種進(jìn)行厭氧PHB，好氧異染顆粒染色，PHB顆粒和異染顆粒均呈藍(lán)黑色。

2.3 菌株除磷測(cè)試結(jié)果

對(duì)4株菌株進(jìn)行除磷性能測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如表1所示。由表1可知，4菌株的除磷率均在85%以上，說明篩選出來的4株菌的除磷效率均較高。研究表明，除磷率在80%以上是聚磷菌的顯著特征[11]。

表1 各菌株的除磷效果

2.4 菌株DNA序列鑒定結(jié)果

圖3 菌株P(guān)HB和異染顆粒染色結(jié)果

對(duì)4株菌株進(jìn)行相關(guān)菌系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，1號(hào)菌株序列與Exigu-obacterium sp.ZWU0009(微小桿菌屬)的16S rDNA相似度最高，相似度為91%，2號(hào)菌株序列與Bacillus sp.C10(芽孢桿菌屬)的16S rDNA相似度最高，相似度為90%，3號(hào)菌株序列與Exiguobacteriumacetylicum strain BGSLP4(乙酰桿菌屬)的16S rDNA相似度最高，相似度為99%，4號(hào)菌株序列與 Exiguobacteriumacetylicum strain SI17(乙酰桿菌屬)的16S rDNA相似度最高，相似度為99%。一般認(rèn)為，相似度在80%以上可明顯體現(xiàn)樣本間的相似度[12]。該研究中4株菌株的相似度均在90%以上，說明4株菌株的鑒定結(jié)果可靠。

圖4 菌株與相關(guān)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

運(yùn)用厭氧/好氧交替平板迭代培養(yǎng)并綜合BCIP藍(lán)白斑篩選、厭氧PHB染色、好氧異染顆粒染色法可以快速準(zhǔn)確的篩選出高效聚磷菌，所篩選出的4株高效聚磷菌除磷率分別為1號(hào)菌85.51%、2號(hào)菌 91.06%、3號(hào)菌 95.51%、4號(hào)菌89.13%。高通量測(cè)序?qū)?株高效聚磷菌進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果表明，1號(hào)菌為Exiguobacterium sp.ZWU0009(微小桿菌屬)、2號(hào)菌為Bacillus sp.C10(芽孢桿菌屬)、3號(hào)菌為 Exiguobacteriumacetylicum strain SI17(乙酰桿菌屬)、4號(hào)菌為Exiguobacteriumacetylicum strain BGSLP4(乙酰桿菌屬)。