劉進(jìn) 柳珂 蔣巍 黃翠云 鄧易 束暢 張鳳

[摘要] 目的 建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測硼替佐米的方法，并用于大鼠血漿硼替佐米濃度的測定。方法 采用蛋白沉淀法處理血漿樣品，色譜柱為Waters XBridge BEH C18 柱（2.5 μm，2.1 mm×50 mm），以乙腈-醋酸銨（10 mmol/L）為流動相梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫為35°C，多反應(yīng)檢測正離子模式分析。 結(jié)果 硼替佐米血漿濃度在0.5～100 ng/mL線性范圍內(nèi)良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y = 14.41X-0.4490（r = 0.9974）。定量下限為0.5 ng/mL，低、中、高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性結(jié)果均良好。 結(jié)論 該法準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于大鼠硼替佐米藥效動力學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞] 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法;硼替佐米;血漿;藥效動力學(xué)

[中圖分類號] R971.1 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（a）-0022-04

Determination of Bortezomib in rat plasma by UHPLC-MS/MS method

LIU Jin1 ? LIU Ke2 ? JIANG Wei3 ? HUANG Cuiyun3 ? DENG Yi3 ? SHU Chang3 ? ZHANG Feng3

1.Department of Hematology， Shanghai Changzheng Hospital， Shanghai ? 200003， China; 2.Department of Oncology， Shanghai Changzheng Hospital， Shanghai ? 200003， China; 3.Department of Pharmacy， Shanghai Changzheng Hospital， Shanghai ? 200003， China

[Abstract] Objective To establish an ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of Bortezomib in rat plasma. Methods Plasma sample preparation was treated by protein precipitation. ColumWaters XBridge？誖 BEH C18 （2.5 μm， 50 mm × 2.1 mm） was used as the column. Acetonitrile and 10 mmol/L ammonium formate solution was used as the mobile phase， with gradient elute， the volume flow rate was 0.3 mL/min， the column temperature was maintained at at 35℃. Multi-reaction detection positive ion mode was used to analysis. Results The Bortezomib in the range of 0.5-100 ng/mL showed a good liner， the standard linear regression equation was Y = 14.41X-0.4490 （r = 0.9974）. The lower limit of quantification was 0.5 ng/mL， and the results of in-day， day-time precision and accuracy， extraction recovery， matrix effect and stability of quality control samples with low， medium and high 3 mass concentrations were all good. Conclusion The method is accurate， sensitive and reproducible， and can be used in the pharmacokinetic study of Bortezomib in rats.

[Key words] Ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometer/mass spectrometer; Bortezomib; Plasma; Pharmacokinetic

化療是多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）主要治療手段[1-3]。作為新型可逆蛋白酶體抑制劑，硼替佐米（Bortezomib，BTZ）顯著提升了MM患者的無進(jìn)展生存期與總體生存期[4]，通常聯(lián)合用藥[5-9]以增強效果。由于BTZ最常見的不良反應(yīng)周圍神經(jīng)病變與其累積劑量密切相關(guān)[10-12]，其體內(nèi)血藥濃度暴露量會受到聯(lián)合用藥的影響[13-15]，而基于動物模型考察其藥物相互作用是評價其臨床安全用藥的有力工具。因此，有必要建立大鼠血漿中BTZ含量測定方法，為后期其藥物相互作用研究提供技術(shù)支撐。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UHPLC-MS/MS）由于其耗時少、高分辨率、高靈敏度的特點而廣泛應(yīng)用于復(fù)雜化合物體系的測定分析[16-19]。因此，本研究基于快速、準(zhǔn)確、靈敏的UHPLC-MS/MS開展血漿中BTZ的濃度檢測，并運用于大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Agilent 1260 UHPLC串聯(lián)6460 QQQ質(zhì)譜系統(tǒng)（安捷倫公司，美國）;CPA2250十萬分之一電子分析天平（賽多利斯，德國）;漩渦混合器（萊伯特公司，美國）;低溫離心冷凍濃縮儀（LaboGene公司，丹麥）;5810R離心機（艾本德公司，德國）;Milli-Q超純水儀（美國）。藥品BTZ（商品名萬珂，批號170620344，西安楊森制藥有限公司）;BTZ和內(nèi)標(biāo)（IS）氟康唑（FLC）購買于大連美侖生物醫(yī)藥有限公司（中國，純度>98%）;乙腈、甲醇購自默克公司（色譜純級，德國）;甲酸購自天地公司（分析純級，美國）。注射用肝素鈉，6250 U/mL;羧甲基纖維素鈉;灌胃針;注射器;眼眶靜脈采血毛細(xì)管。

1.2 實驗動物及藥動學(xué)研究

SD雄性大鼠6只（180～220 g），購自斯萊克實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2007-0005]，實驗前禁食12 h，自由飲水。BTZ尾靜脈注射（0.15 mg/kg）后，進(jìn)行如下12個時間點的眼眶后靜脈叢取血：5、15、30 min，1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters XBridge BEH C18柱（2.5 μm，2.1 mm×50 mm），柱溫維持在35°C;進(jìn)樣體積5 μL;流動相為乙腈（A相）和10 mmol/L醋酸銨溶液（B相），流速為0.3 mL/min，梯度洗脫程序為0-0.5-1.5-1.6-2.5-3.0 min，A相20%-60%-60%-95%-95%-20%。質(zhì)譜條件見表1。

表1 ? 質(zhì)譜檢測參數(shù)和化合物MRM檢測參數(shù)

注：ESI：電噴霧電離源;MRM：多反應(yīng)檢測掃描;BTZ：硼替佐米;FLC：氟康唑;IS：內(nèi)標(biāo)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制

配置1.00 mg/mL BTZ、FLC儲備液，于-80°C保存。以10%甲醇水溶液稀釋BTZ儲備液，得濃度為5、10、20、50、100、500、1000 ng/mL的工作溶液;以含0.1%甲酸的乙腈進(jìn)行稀釋，配制成含10 ng/mL FLC的蛋白沉淀劑。精密吸取BTZ工作溶液100 μL，分別加入空白血漿900 μL，依次配制成含BTZ濃度分別為0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，渦旋混勻后備用。同理配置濃度為1、5、50 ng/mL的質(zhì)控樣本。

2.3 血漿樣品制備

于1.5 mL含肝素鈉5 μL的塑料離心管中，加入空白血漿100 μL和200 μL含10 ng/mL IS的乙腈，進(jìn)行蛋白沉淀，渦旋混勻30 s后，12 000 r/min離心10 min（離心半徑9.5 cm），取上清5 μL進(jìn)樣。

2.4數(shù)據(jù)分析

采用Agilent Masshunter B.06.00工作站（安捷倫公司，美國）、Drug and Statistics 2.0 version 統(tǒng)計學(xué)軟件（DAS 2.0，中國藥理學(xué)會）對液質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。

2.5 方法專屬性

在測試的6份空白血樣中未見有與標(biāo)準(zhǔn)添加樣品中各個待測化合物相同碎片離子及相同出峰位置的干擾雜質(zhì);在大鼠服藥后的血樣與標(biāo)準(zhǔn)添加樣品中BTZ的離子碎片及出峰位置相對應(yīng)，本法專屬性良好。見圖1。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線

按“2.2”項下操作制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)質(zhì)控樣本，進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。以BTZ的血藥濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積AS與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行權(quán)重回歸（權(quán)重系數(shù)為w=1/C2）。根據(jù)Mass Hunter軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 14.41X-0.4490（r = 0.9974），其在0.5～100.0 ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限（LLOQ）為0.5 ng/mL。

2.7 精密度與準(zhǔn)確度

將LLOQ及3個不同濃度質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測，每個濃度平行配制5份樣品，計算得樣品批內(nèi)和批間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.46%～5.11%，準(zhǔn)確度相對誤差（RE）為-8.36%～9.67%。見表2。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)與回收率

取6份不同來源的空白大鼠血漿按照“2.3”項下制備血漿樣品后，加入低、中、高BTZ溶液及內(nèi)標(biāo)溶液得提取后添加溶液，測得BTZ峰面積A1;類似地，用10%甲醇水溶液配置低、中、高的水標(biāo)樣品，同法測得BTZ峰面積A2，根據(jù)公式A1/A2×100%計算基質(zhì)效應(yīng)?？瞻籽獫{加入適量的BTZ工作溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，配置成低、中、高的提取后添加樣品，按照“2.3”項下制備血漿樣品后，同法測得峰面積A3，計算提取回收率（A3/A1×100%）。結(jié)果顯示樣本提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均在可接受范圍，見表3。

2.9 樣品穩(wěn)定性

采用低中高濃度質(zhì)控樣品，考察凍融循環(huán)穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性、樣本處理后穩(wěn)定性。低中高濃度質(zhì)控樣品各種不同類型的穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，相對誤差在可接受范圍內(nèi)（-10.82%～8.22%）、在上述條件下，樣本均未發(fā)生明顯的降解、變質(zhì)現(xiàn)象。見表4。

2.10 稀釋效應(yīng)

將血樣以大鼠空白血漿稀釋10、50倍后的實測濃度與理論濃度比較，其準(zhǔn)確度分別為3.44%、6.87%;RSD分別為3.94%、3.40%（n = 3）。

2.11 藥動學(xué)研究結(jié)果

以血藥濃度對給藥時間作圖得BTZ在大鼠體內(nèi)消除的平均血藥濃度-時間曲線圖。見圖2。計算得藥代動力學(xué)參數(shù)：AUC0～t（72.32±16.46）（h·ng/mL），AUC0～∞（163.90±77.58）（h·ng/mL），MRT0～∞（39.96±11.39） h，t1/2（0.14±0.048）h，Cmax（22.69±8.36）ng/mL。

3討論

3.1 UHPLC-MS/MS方法學(xué)改進(jìn)

課題組前期建立了MM常用化療方案中包括BTZ在內(nèi)的6種藥物人血漿濃度的檢測方法，采用固相萃取法進(jìn)行前處理，且每個樣本液質(zhì)分析時間為10 min[20]。本研究只對BTZ開展分析，因此為了縮短分析時間、降低檢測成本，根據(jù)待測物性質(zhì)將方法調(diào)整為較為簡便廉價的蛋白沉淀法。其次，考察了Agilent ZORBAX SB C18柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent poroshell SB C18柱（2.7 μm，2.1 mm×75 mm）以及Waters XBridge？誖 BEH C18柱（2.5 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱對分析的影響，結(jié)果化合物在Waters XBridge？誖BEH C18柱上峰形、響應(yīng)和重現(xiàn)性較好。

3.2 UHPLC-MS/MS方法學(xué)應(yīng)用

將建立的分析方法成功用于BTZ經(jīng)靜脈注射后在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。結(jié)果顯示，BTZ進(jìn)入血液循環(huán)后迅速分布并代謝，生物半衰期較短（約1.5 h），可推斷其進(jìn)入體內(nèi)快速代謝而發(fā)揮抗腫瘤功效。

3.3 總結(jié)

本研究基于UHPLC-MS/MS對大鼠血漿中BTZ開展快速檢測，方法學(xué)驗證結(jié)果符合生物樣本分析要求，成功用于BTZ在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?China Multiple Myeloma Working Group. Guidelines for the diagnosis and treatment of multiple myeloma in China [J]. Chin J Intern Med，2013，52（9）：791-795.

[2] ?Antonio P，Kenneth A. Multiple Myeloma [J]. N Engl J Med，2011，364（11）：1046-1060.

[3] Kumar SK，Callander NS，Alsina M，et al. NCCN Guidelines Insights：Multiple Myeloma，Version 3.2018 [J]. J Natl Compr Canc Netw，2018，16：11-20.

[4] ?Sun C，Li J，Chu Z，et al. Efficacy and safety of bortezomib maintenance in patients with newly diagnosed multiple myeloma：a meta-analysis [J]. Biosci Rep，2017，37（4）：BSR2 0170304.

[5] ?Einsele H，Engelhardt M，Tapprich C，et al. Phase Ⅱ study of bortezomib，cyclophosphamide and dexamethasone as induction therapy in multiple myeloma：DSMM Ⅺ trial [J]. Br J Haematol， 2017，179（4）：586-597.

[6] ?Richardson PG，Sonneveld P，Schuster MW，et al. Bortezomib or High-Dose Dexamethasone for Relapsed Multiple Myeloma [J]. N Engl J Med，2005，352（24）：2487-2498.

[7] ?Mai EK，Bertsch U，Durig J，et al. Phase Ⅲ trial of bortezomib，cyclophosphamide and dexamethasone （VCD） versus bortezomib，doxorubicin and dexamethasone （PAd） in newly diagnosed myeloma [J]. Leukemia，2015，29（8）：1721-1729.

[8] ?Moreau P，Hulin C，Macro M，et al. Bortezomib，Thalidomide and Dexamethasone （VTD） Is Superior to Bortezomib，Cyclophosphamide and Dexamethasone （VCD） Prior to Autologous Stem Cell Transplantation for Patients with De Novo Multiple Myeloma. Results of the Prospective IFM 2013-04 Trial [J]. Blood，2015，126（23）：393.

[9] ?Miguel JF，Schlag R，Khuageva NK，et al. Bortezomib plus melphalan and prednisone for initial treatment of multiple myeloma [J]. N Engl J Med，2008，359（9）：906-917.

[10] ?Merz M，Salwender H，Haenel M，et al. Peripheral neuropathy associated with subcutaneous or intravenous bortezomib in patients with newly diagnosed myeloma treated within the GMMG MM5 phase Ⅲ trial [J]. Haematologica，2016，101（12）：e485-e487.

[11] ?Argyriou AA，Cavaletti G，Bruna J，et al. Bortezomib-induced peripheral neurotoxicity：an update [J]. Archives of Toxicology，2014，88（9）：1669-1679.

[12] ?Koh Y，Lee SY，Kim I，et al. Bortezomib-associated peripheral neuropathy requiring medical treatment is decreased by administering the medication by subcutaneous injection in Korean multiple myeloma patients [J]. Cancer Chemother Pharmacol， 2014， 74：653-657.

[13] ?Quinn DI，Nemunaitis J，F(xiàn)uloria J，et al. Effect of the Cytochrome P450 2C19 Inhibitor Omeprazole on the Pharmacokinetics and Safety Profile of Bortezomib in Patients with Advanced Solid Tumours，Non-Hodgkin′s Lymphoma or Multiple Myeloma [J]. Clin Pharmacokinect，2009，48（3）：199-209.

[14] ?Iwamoto T，Ishibashi M，F(xiàn)ujieda A，et al. Drug Interaction Between Itraconazole and Bortezomib：Exacerbation of Peripheral Neuropathy and Thrombocytopenia Induced by Bortezomib [J]. Pharmacotherapy，2010，30（7）：661-665.

[15] ?Venkatakrishnan K，Rader M，Ramanathan RK，et al. Effect of the CYP3A inhibitor ketoconazole on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of bortezomib in patients with advanced solid tumors：A prospective，multicenter，open-label，randomized，two-way crossover drug—drug interaction study [J]. Clin Ther，2009，31：2444-2458.

[16] ?Gosetti F，Mazzucco E，Gennaro MC，et al. Ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry determination and profiling of prohibited steroids in human biological matrices [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，927：22-36.

[17] ?Adaway J，Keevil BG. Therapeutic drug monitoring and LC-MS/MS [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2012，883-884：33-49.

[18] ?Pohanka A，Rosenborg S，Lindh JD，et al. Experiences from using LC-MS/MS for analysis of immunosuppressive drugs in a TDM service [J]. Clin Biochem，2016，49（49）：1024-1031.

[19] ?Rafael R，Laurence L，Marie A，et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometric assay for therapeutic drug monitoring of the EGFR inhibitors afatinib，erlotinib and osimertinib，the ALK inhibitor crizotinib and the VEGFR inhibitor nintedanib in human plasma from non-small cell lung cancer patients [J]. J Pharm Biomed Anal，2018，158：174-183.

[20] ?Shu C，Zeng T，Gao S，et al. LC-MS/MS method for simultaneous determination of thalidomide，lenalidomide，cyclophosphamide，bortezomib，dexamethasone and adriamycin in serum of multiple myeloma patients [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2016， 1028：111-119.

（收稿日期：2019-07-30 ?本文編輯：劉永巧）