吉秀家 王艷波 李芳

[摘要]目的 運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討“女貞子-墨旱蓮”藥對的主要活性成分、靶點，初步研究其藥理學(xué)作用機制，為進一步深入探討其藥理學(xué)作用提供新線索。方法 通過文獻挖掘及檢索數(shù)據(jù)庫的方法篩選出“女貞子-墨旱蓮”的主要活性成分、靶點，構(gòu)建成分-靶點數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，獲取靶點信息。篩選出關(guān)鍵靶點，利用metascape系統(tǒng)進行富集和通路分析。結(jié)果 經(jīng)篩選得到“女貞子-墨旱蓮”有活性成分24個，共248個靶點，主要涉及體液調(diào)節(jié)、對氧反應(yīng)、細胞凋亡、神經(jīng)受體相互作用等生物學(xué)過程中的多條信號通路。結(jié)論 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步揭示了“女貞子-墨旱蓮”藥對的主要藥理學(xué)機制。

[關(guān)鍵詞]網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);女貞子;墨旱蓮;活性成分

[Abstract] Objective To explore the main active ingredients and targets of the ″Fructus Ligustri Lucidi-Ecliptae Herba″? drug pair using the network pharmacology method， so as to study the mechanism of pharmacological action， and provide a new clue for further in-depth study of its pharmacological effect. Methods By searching the TCMSP database， combined the oral bioavailability and chemochemical property analysis， the effective components and target information of limond-inkwort were screened， and Cytoscape software was used to construct the component-target network to obtain the target information. Metascape system was used to annotate and analyze gene function and pathway. Results A total of 24 candidate active molecules were screened from the ″Fructus Ligustri Lucidi-Ecliptae Herba″ drug pair， acting on 248 targets， mainly involving multiple signaling pathways in biological processes such as humoral regulation， oxygen response， cell apoptosis， and neural receptor interaction. Conclusion Network pharmacology method reveales the main pharmacological mechanism of ″Fructus Ligustri Lucidi-Ecliptae Herba″ drug pair.

[Key words] Network pharmacology; Fructus Ligustri Lucidi; Ecliptae Herba; Active ingredient

二至丸（Erzhiwan，EZW）是由女貞子、墨旱蓮組成的我國的經(jīng)典名方，出自清代《醫(yī)方集解》，兩者均歸肝腎經(jīng)，具有補益肝腎、滋陰養(yǎng)血的功效，常用于肝腎陰虛、腰膝酸軟、頭暈耳鳴等證[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果顯示，二至丸具有抗氧化、抗惡性腫瘤、抗炎、改善血流變及調(diào)節(jié)免疫等諸多功效[4]。目前大部分研究主要針對藥物對個體或個別分子的研究，但如何從整個分子層面上對女貞子-墨旱蓮的作用機制、組方依據(jù)進行研究，目前尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology）是基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)分析，系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示多分子藥物協(xié)同作用的特點[5]。采用系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)，識別中藥活性物質(zhì)、確定活性物質(zhì)的作用靶點，并運用網(wǎng)絡(luò)分析方法建立藥物分子、靶點、細胞、組織、器官之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，明確藥效物質(zhì)和疾病的關(guān)系，借以闡明和預(yù)測中藥療效和毒性。本研究嘗試用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建“女貞子-墨旱蓮”藥對的主要活性物質(zhì)、靶點的網(wǎng)絡(luò)模型，以期為闡明“女貞子-墨旱蓮”藥對的藥理作用機制提供參考。

1資料與方法

1.1藥物活性成分及靶標的獲取

利用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)及分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）收集女貞子、墨旱蓮的所有化學(xué)成分。考慮到藥物進入體內(nèi)不可能全部吸收，故將篩選條件限定為：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性指數(shù)（drug like index，DL）≥0.1。然后根據(jù)各個成分的ADME性質(zhì)遴選出女貞子-墨旱蓮的活性成分及其對應(yīng)的候選靶標。由于檢索到的藥物靶標命名不太規(guī)范，故使用UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org）中的UniProtKB功能，輸入靶點名稱并將物種設(shè)定為人，檢索到靶標的蛋白名稱。

1.2活性成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將收集到的女貞子、墨旱蓮的候選化合物與潛在的靶點利用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建出該藥對“活性成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)模型。運用Network Analyzer插件進行網(wǎng)絡(luò)特征的分析。

1.3生物學(xué)過程及通路分析

將女貞子、墨旱蓮的靶標蛋白導(dǎo)入到metascape軟件（http：//metascape.org），得到相應(yīng)基因列表;然后對基因列表進行富集分析及通路分析。

2結(jié)果

2.1“女貞子-墨旱蓮”藥對中的候選活性成分分析

篩選后得到女貞子活性成分18個，墨旱蓮活性成分13個，共29個（含有2個共同成分）候選化合物，其中有5個未找到靶標，剩余24個找到靶標248個，11個無人類基因，最終獲得靶標237個。女貞子篩選后的成分主要以長蒴黃麻苷（苷元）（olitoriside_qt）、圣草酚（eriodictyol）、金吉苷（苷元）（kingiside_qt）等為主;墨旱蓮主要含（Z）-1-（2，4 -二羥基苯基）3-3，4-二羥基苯基prop-2-en-1-1[（Z）-1-（2，4-dihydroxyphenyl）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）prop-2-en-1-1]、去甲蟛蜞菊內(nèi)酯（demethylwedelolactone）、漆黃素（butin）等為主（表1）。

2.2“活性成分-靶標”網(wǎng)絡(luò)分析

通過Cytoscape3.7.0軟件繪制出“女貞子-墨旱蓮”藥對的“活性成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。共包括261個節(jié)點和495條邊，每條邊代表靶標與活性成分之間的相互關(guān)系。261個節(jié)點中包括24個化學(xué)成分和248個潛在作用靶標。其中每個活性成分平均作用于20.63（495/24）個靶標，每個靶標鏈接藥物數(shù)量平均為2.00（495/248），反映出女貞子-墨旱蓮藥對發(fā)揮藥效的過程是以多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶標、整體協(xié)同的方式完成的。

結(jié)果顯示，擁有最多潛在靶標的是槲皮素（quercetin），共135個;其次是山萘酚（kaempferol），包含62個;木犀草素（luteolin）含57個，β-谷固醇（β-sitosterol）含37個潛在靶標。這幾個化合物可能在女貞子-墨旱蓮藥對的藥理過程中起關(guān)鍵作用。研究顯示，槲皮素、山奈酚、木犀草素具有抗腫瘤、抗氧化、抗血小板聚集、抗炎及調(diào)節(jié)免疫保護神經(jīng)等多種藥理作用[6-9]。β-谷固醇是一種植物固醇，具有較好的降血脂作用[10]。另外，結(jié)果顯示，靶點括前列腺素G/H合酶（2PTGS2）、熱休克蛋90AB1（HSP90AB1）、核受體輔激活蛋白2（NCOA2）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1）擁有最多的配體。研究顯示，PTGS2主要參與癌癥[11]、炎癥反應(yīng)[12]以及心血管疾病，如動脈粥樣硬化、血栓性疾病[13]等多種病理過程;HSP90可以抑制肺腺癌細胞[14]遷移、增殖，誘導(dǎo)肺腺癌細胞凋亡，并且可以增加肺腺癌細胞體外放射敏感性[15];NCOA2對脂肪沉積有著重要的調(diào)控作用[16];PTGS1主要被認為參與細胞間信號傳導(dǎo)和維持組織體內(nèi)平衡。因此，可推測“女貞子-墨旱蓮”藥對主要在炎性反應(yīng)、抗腫瘤等領(lǐng)域發(fā)揮較好的生物學(xué)活性。

2.3靶標的富集及通路分析

運用metascap軟件對潛在的靶標進行生物學(xué)分析。結(jié)果顯示，“女貞子-墨旱蓮”藥對的靶標基因主要富集在1123個生物學(xué)過程。主要富集過程包括：對無機物的反應(yīng)（response to inorganic substance）、調(diào)節(jié)體液水平（regulation of body fluid levels）、活性氧代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）、細胞對氮化合物的反應(yīng)（cellular response to nitrogen compound）、氧水平反應(yīng)（response to oxygen levels）、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)（response to nutrient levels）、細胞遷移的正調(diào)控（positive regulation of cell migration）、上皮細胞凋亡過程（epithelial cell apoptotic process）、血液循環(huán)（blood circulation）、凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、腺發(fā)育（gland development）等（圖2，見封四）。

通路分析結(jié)果共得到信號通路228條，顯著性較高的通路如下：白細胞介素信號（signaling by interleukins）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥通路（pathways in cancer）、糖尿病并發(fā)癥AGR受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）等（表2）。

3討論

中醫(yī)“同病異治，異病同治”的整體觀念，為通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究中藥提供了新思路。中醫(yī)治療主要基于整體觀念的思維模式，實現(xiàn)多維調(diào)控的復(fù)雜理論體系，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于多靶點的研究策略十分相似。因此，通過“靶點-藥物-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)去分析中藥活性成分的藥理機制，找到疾病新靶點的概率可能會增加[17]。

本研究結(jié)果從“女貞子-墨旱蓮”藥對中篩選出候選活性分子24個，預(yù)測出248個相應(yīng)的靶點。通過構(gòu)建活性成分和靶點網(wǎng)絡(luò)模型并分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)度值較高的候選活性分子分別是槲皮素、山萘酚、木犀草素、β-谷固醇，度值較高的靶點蛋白為PTGS2、HSP90AB1、NCOA2、PTGS1，這些活性成分和靶點可能是藥對中發(fā)揮關(guān)鍵作用的物質(zhì)。通過富集分析和通路分析得出藥對中活性成分的靶點主要參與的生物過程包括體液調(diào)節(jié)、對氧反應(yīng)、細胞凋亡、神經(jīng)受體相互作用等，主要在調(diào)控腫瘤、炎癥與免疫相關(guān)類通路發(fā)揮其藥理作用。本研究結(jié)果顯示，二至丸可以作用于多個靶點，發(fā)揮多種治療作用，尤其是對腫瘤性疾病。周步高等[18]的研究結(jié)果顯示，二至丸防治腫瘤機制與其調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸和免疫編輯等作用相關(guān)。