孫 雪 趙曉燕 朱運(yùn)平 張曉偉 劉紅開 朱海濤

(濟(jì)南大學(xué)烹飪學(xué)院食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系1,濟(jì)南 250022)

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院2, 北京 102488)

植物蛋白是從植物中萃取的一類蛋白質(zhì)，其來(lái)源廣泛，營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物蛋白相近，經(jīng)過(guò)加工后不僅更容易被人體所吸收，而且由于植物蛋白膽固醇和飽和脂肪酸含量極低，所以較動(dòng)物蛋白更加健康。此外，植物蛋白具有多種生理保健功能，如降低膽固醇、抗氧化和降血壓等[1]。傳統(tǒng)分離植物蛋白的方法有堿提酸沉法、雙向水相分離法、酶解法等，但缺點(diǎn)是萃取過(guò)程復(fù)雜、效率低、成本高、污染環(huán)境等，難以滿足現(xiàn)代工業(yè)化的需要。反膠束提取法是在20世紀(jì)80年間早期開發(fā)出用于分離和提純的技術(shù)，該方法具有選擇性高、能耗低、提取條件溫和、易工業(yè)化生產(chǎn)，并且能夠有效防止提取物失活和變性等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于生物大分子，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等的分離和純化[2]。目前，反膠束提取技術(shù)已應(yīng)用于生物、化學(xué)、食品和醫(yī)藥等許多領(lǐng)域，具有廣闊的發(fā)展前景[2]。本文將從反膠束提取蛋白質(zhì)的基本原理以及國(guó)內(nèi)外有關(guān)反膠束體系提取植物蛋白質(zhì)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行論述。

1 反膠束萃取法概述

正常膠束是指表面活性劑溶于水中的濃度高于臨界膠束濃度(CMC)時(shí),聚合在一起形成的親水基向外、疏水基向內(nèi)的聚集體[3]。反膠束是指油相中表面活性劑的濃度超過(guò)CMC后,其親水極性頭自發(fā)向內(nèi)與水接觸，疏水非極性尾向外與非極性有機(jī)溶劑接觸所形成的具有熱力學(xué)穩(wěn)定性和光學(xué)透明性的納米級(jí)聚合體(見圖1)。反膠束中有機(jī)溶劑包裹著水形成“水池”，具有溶解極性物質(zhì)的特性，如氨基酸，酶和抗生素等，在提取過(guò)程中，生物大分子被包封在反膠束中，避免了與有機(jī)溶劑直接接觸而發(fā)生變性[4]。水溶性生物分子溶解在反膠束的“水池”中，稱為前萃(見圖2)；通過(guò)改變水相條件(例如pH、離子濃度等)使含有生物分子的前萃液與另一種水相接觸，將產(chǎn)物從反膠束移動(dòng)到水相的流程稱為“后萃”[5]。

圖1 正常膠束與反膠束示意圖

圖2 反膠束前萃和后萃過(guò)程

反膠束法作為新技術(shù)，主要涉及兩方面:萃取工藝和萃取過(guò)程動(dòng)力學(xué)，通過(guò)調(diào)控影響因素，可以優(yōu)化萃取工藝和研究萃取過(guò)程動(dòng)力學(xué)，從而使反膠束技術(shù)得到更好的應(yīng)用。

2 反膠束對(duì)植物蛋白應(yīng)用的影響

2.1 植物蛋白和油脂的同時(shí)分離

傳統(tǒng)萃取油脂的方法有很多，主要有壓榨法和浸出法，壓榨法存在出油率低、成本高、雜質(zhì)較多等缺點(diǎn)；浸出法存在有溶劑殘留、易引起蛋白質(zhì)變性，造成蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)等缺點(diǎn)。反膠束法在分離蛋白質(zhì)和油脂時(shí)，有機(jī)相溶解油脂，“水池”溶解蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，該方法存在操作簡(jiǎn)單、可連續(xù)處理、萃取條件溫和、成本低且不會(huì)引起生物活性物質(zhì)失活等優(yōu)點(diǎn)，在食品加工行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景[6]。如表1所示，反膠束法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多種植物蛋白和其油脂的分離純化實(shí)驗(yàn)，這也證明了該方法應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中的可行性。

表1 反膠束法分離不同植物蛋白和油脂的萃取條件和萃取率

2.2 植物蛋白組分和蛋白混合物的分離

反膠束體系分離蛋白混合物和植物蛋白組分是根據(jù)不同種類蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成等差別，通過(guò)改變前萃和后萃的分配系數(shù)，調(diào)整體系相關(guān)參數(shù)(如pH值、離子種類和強(qiáng)度等)，使目標(biāo)蛋白選擇性的提取到有機(jī)相或水相中，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物分級(jí)分離的目的。

植物蛋白中存在多種蛋白組分，這些蛋白組分的結(jié)構(gòu)和功能存在差別，如大豆蛋白主要是由7S、11S球蛋白所構(gòu)成，而這兩個(gè)組分之間具有不同結(jié)構(gòu)和功能，它們的空間構(gòu)象、溶解性、乳化性等都存在差別，所以分離植物蛋白組分對(duì)研究植物蛋白的功能特性和豐富植物蛋白應(yīng)用提供了更多可能[6]。如表2所示，反膠束法在分離蛋白混合物和植物蛋白組分上有著較高的提取率，但此類研究較少，應(yīng)加大此方面研究，為其應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)上提供更多理論基礎(chǔ)。

表2 反膠束分離不同蛋白混合物最優(yōu)萃取條件

3 反膠束對(duì)植物蛋白結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性密切相關(guān)，如牛胰核糖核酸酶的變性與復(fù)性實(shí)驗(yàn)就是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系有力的實(shí)證[11]，而萃取方法和條件的不同也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成不同程度的影響，從而影響蛋白質(zhì)的功能。在反膠束提取植物蛋白時(shí)，影響反膠束提取的因素有很多，如表面活性劑的種類、離子的強(qiáng)度以及pH等，當(dāng)離子強(qiáng)度過(guò)高時(shí)則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活，從而對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性造成影響[12]。因此，研究反膠束提取法對(duì)植物蛋白結(jié)構(gòu)的影響，也為植物蛋白功能特性的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3.1 植物蛋白的分子質(zhì)量

相關(guān)文獻(xiàn)表明，與反膠束法制備的大豆分離蛋白相比，堿提酸沉法制得的蛋白α亞基具有部分解離現(xiàn)象，條帶削弱分解造成分子質(zhì)量變小，表明反膠束提取法對(duì)大豆蛋白分子的結(jié)構(gòu)影響較小[13]。最新研究成果得出，反膠束法制備的榛仁蛋白亞基分子質(zhì)量集中在16～73 ku范圍之間，分子質(zhì)量大于75 ku的亞基幾乎沒有;而堿溶酸沉法提取的榛仁蛋白亞基分子質(zhì)量主要集中在132.21、65.24、50 ku附近，分子質(zhì)量小于36 ku的亞基幾乎沒有[7]。這可能是與反膠束的尺寸有關(guān)，也可能是因?yàn)樾》肿淤|(zhì)量蛋白在反膠束中的溶解能力更強(qiáng)。李潤(rùn)潔等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不同方法萃取的大豆蛋白質(zhì)組分存在差異，相比于堿溶酸沉淀法，四種反膠束體系[2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)、AOT-Tween60、十二烷基磺酸鈉(SDS)、SDS-Tween60]制備的大豆蛋白小分子質(zhì)量亞基較多，主要集中在16～42 ku之間。曾有研究報(bào)道，采用超聲波輔助的反膠束體系提取的大豆蛋白大分子質(zhì)量亞基含量高于單一反膠束體系，這是因?yàn)榉茨z束受“水池”尺寸的影響,提取大分子質(zhì)量蛋白的能力較差,但加入超聲輔助后, 超聲波利用聲空化能來(lái)收集能量,使反膠束中的氣泡在超聲波作用下瞬間瓦解并釋放能量，瞬間產(chǎn)生的熱量為反膠束提取大分子質(zhì)量蛋白提供了動(dòng)力支持[14]。

與傳統(tǒng)提取方法相比，反膠束法提取的植物蛋白小分子質(zhì)量亞基較多，而大分子質(zhì)量亞基較少，這表明反膠束具有更強(qiáng)提取較小分子質(zhì)量蛋白的能力，并且提取較大分子質(zhì)量蛋白的能力較弱，但在加入超聲波輔助后，反膠束體系提取大分子質(zhì)量植物蛋白的能力有所提高，說(shuō)明了反膠束法的靈活性。

3.2 氨基酸的組成和含量

氨基酸組成和含量是評(píng)判食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，尤其是8種必需氨基酸的含量和組成比，是評(píng)判蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要依據(jù)[15]。

相關(guān)文獻(xiàn)表明，反膠束法提取的大豆7S和11S球蛋白的氨基酸含量顯著高于水相法提取的7S、11S球蛋白，特別是反膠束提取的11S球蛋白必需氨基酸總含量也顯著高于水相法提取的11S球蛋白[16]，表明反膠束法制備的大豆蛋白更好的保留了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。據(jù)報(bào)道，反膠萃取法和堿提酸沉淀法提取的核桃蛋白在氨基酸種類上并沒有差別，但反膠束法制備的核桃蛋白氨基酸總量和7種必需氨基酸含量均高于堿溶酸沉法所提取的核桃蛋白[17]。

蛋白質(zhì)的特定功能是由其特定的構(gòu)象所決定的，而特定的構(gòu)象又與其一級(jí)結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，所以蛋白質(zhì)在萃取過(guò)程中氨基酸組成、含量的變化,可能會(huì)引起蛋白功能特性的改變，如鐮刀狀貧血癥產(chǎn)生的原因就是血紅蛋白的β-肽鏈上第6位谷氨酸被纈氨酸所替代[18]。反膠束法提取的植物蛋白與傳統(tǒng)萃取方法相比能夠較大程度地保證其氨基酸組成以及含量，從而保護(hù)蛋白的功能特性。

3.3 植物蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

不同的萃取方法將會(huì)對(duì)植物蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，這種影響可能會(huì)引起蛋白功能特性的改變。如表3所示，反膠束法提取的榛仁蛋白不規(guī)則構(gòu)象含量明顯低于堿溶酸沉法，但α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量顯著增加，這很有可能是兩種構(gòu)象之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[7]，而這種構(gòu)象比例的改變可能會(huì)對(duì)植物蛋白的功能特性造成影響。此外可以發(fā)現(xiàn)，反膠束法提取的花生蛋白中存在α-螺旋結(jié)構(gòu)，但水相法萃取的花生蛋白中則沒有α-螺旋結(jié)構(gòu)[19]，而α-螺旋是蛋白質(zhì)中最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式，是遺傳信息傳遞與表達(dá)和肽鏈進(jìn)一步折疊形成不同構(gòu)象的分子基礎(chǔ)[20]，這說(shuō)明反膠束法較大程度保留了花生蛋白的空間結(jié)構(gòu)。

表3 不同方法制備的植物蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

時(shí)冬梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)，水相法提取的11S球蛋白為球狀結(jié)構(gòu)，AOT反膠束提取的11S球蛋白為桿狀或小球狀結(jié)構(gòu)，而SDS反膠束提取的大豆11S球蛋白為光滑的片狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明不同的反膠束體系可以改變11S球蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，而這種變化可能會(huì)影響其功能特性。相關(guān)文獻(xiàn)表明，AOT反膠束提取的大豆7S和11S球蛋白粒徑間孔隙小于水相法提取的7S和11S球蛋白[16]，這是因?yàn)楸砻婊钚詣┡c蛋白質(zhì)發(fā)生了親水相互作用，引起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，此外反膠束體系的pH 值、溫度等也可能對(duì)蛋白質(zhì)分子孔隙大小產(chǎn)生影響。最新研究表明，反膠束法提取的核桃蛋白球蛋白相比于堿溶酸沉法提取的球蛋白更小，但球體完整、表面光滑，球蛋白空間結(jié)構(gòu)更為緊密、穩(wěn)定性更好，說(shuō)明反膠束法對(duì)小分子質(zhì)量蛋白的空間保護(hù)能力較強(qiáng)[17]。

反膠束提取法與傳統(tǒng)提取方法相比較大程度的保留了植物蛋白的空間結(jié)構(gòu)，并且對(duì)小分子質(zhì)量蛋白空間結(jié)構(gòu)保護(hù)能力更強(qiáng)，但萃取較大分子質(zhì)量蛋白時(shí)會(huì)對(duì)其進(jìn)行不同程度的物理改性，而萃取條件的改變也會(huì)對(duì)蛋白的形狀造成影響。通過(guò)控制反膠束法的萃取條件和過(guò)程，可為植物蛋白功能特性的改造提供幫助，進(jìn)而提高植物蛋白的應(yīng)用范圍。

4 反膠束對(duì)植物蛋白功能性的影響

植物蛋白含有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，取材來(lái)源廣泛，因此普遍應(yīng)用于乳制品、肉制品、面食及飲料等行業(yè)的生產(chǎn)加工中。對(duì)反膠束法提取的植物蛋白功能特性進(jìn)行研究，有助于改良植物蛋白的溶解性、持水性、乳化性和發(fā)泡性，進(jìn)而提高植物蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、消化利用率和保健功效。

4.1 植物蛋白溶解性和持水性

溶解度的大小是展現(xiàn)蛋白質(zhì)其他功能特征的先決條件，如發(fā)泡性、乳化性和凝膠性都取決于蛋白質(zhì)的起始溶解度，具有較高溶解度并且易于分散的蛋白質(zhì)可應(yīng)用于飲品的生產(chǎn)加工。持水性的高低直接決定著產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)地和組成狀態(tài)，它與食品儲(chǔ)藏過(guò)程中保鮮以及保型有密不可分的關(guān)系。

表4 不同萃取方法制備植物蛋白的溶解性和持水性

從表4可以看出，反膠束法與傳統(tǒng)法相比所提取的植物蛋白溶解性更好，而持水性根據(jù)萃取條件的變化也會(huì)發(fā)生改變。與堿提酸沉法相比，反膠束法所制得的菜籽蛋白和大豆蛋白溶解度更高，但持水性較差[22-23]，這可能是因?yàn)榉茨z束法提取的植物蛋白分子質(zhì)量較小，而小分子蛋白更易溶解，但蛋白濃度較小，疏水作用也就比較強(qiáng)，這就造成其持水能力弱；但超聲波輔助后的SDS反膠束體系提取的大豆11S球蛋白溶解性和持水性均高于水相法所提取的11S球蛋白[20]，這是由于加入超聲波輔助后，反膠束提取大豆蛋白時(shí)增加了11S球蛋白中大分子質(zhì)量蛋白的萃取率，使得蛋白濃度增加，持水能力提高。此外，不同反膠束體系也會(huì)引起植物蛋白溶解性和持水性的變化，例如AOT/SDS復(fù)合反膠束體系提取的花生蛋白溶解性和持水性均高于AOT，SDS單一反膠束體系[5]。反膠束提取法的多樣性，為改善植物蛋白的性能提供了更多可能。

4.2 植物蛋白的熱穩(wěn)定性

食品加工過(guò)程中，由于加熱導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性稱為熱變性。熱變性溫度是影響蛋白質(zhì)加工的一個(gè)重要因素，熱變性會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)其功能特性產(chǎn)生影響。因此研究反膠束法提取的植物蛋白熱穩(wěn)定性，對(duì)食品生產(chǎn)加工的應(yīng)用具有非常重要的意義。

從表5可以看出，反膠束法制備的植物蛋白變性溫度較高，證明反膠束法對(duì)植物蛋白的破壞較小，蛋白質(zhì)變性較少，熱穩(wěn)定性較好。植物蛋白變性溫度的提高，不僅可以更好的保護(hù)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及功能特性，而且降低了植物蛋白在食品生產(chǎn)加工中的難度。但從焓變值可以看出，達(dá)到變性溫度時(shí)反膠束法萃取的植物蛋白變性所需熱量并不大，更易受到熱破壞。這就要求在實(shí)際生產(chǎn)加工中控制溫度的變化，在不達(dá)到植物蛋白變性溫度的基礎(chǔ)上進(jìn)行生產(chǎn)加工。

表5 不同萃取方法制備植物蛋白的變性溫度和變性焓

4.3 植物蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性

蛋清蛋白的起泡性，在蛋糕類食品中的應(yīng)用十分普遍，但蛋清蛋白中含有較多的膽固醇，并且蛋清蛋白的價(jià)格高于植物蛋白[26]。研究植物蛋白的發(fā)泡特性和泡沫穩(wěn)定性為尋找蛋清蛋白的替代品提供了基礎(chǔ)，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

陳銀鶴等[27]對(duì)比了堿溶酸沉淀法和反膠束萃取法制備的菜籽蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)反膠束法制備的菜籽蛋白發(fā)泡性更好，但泡沫穩(wěn)定性則不如堿溶酸沉法萃取的菜籽蛋白。這或許是因?yàn)榉茨z束提取小分子質(zhì)量蛋白的能力更強(qiáng)，并且小分子質(zhì)量蛋白更容易在空氣/水界面吸附和擴(kuò)散，降低了界面張力，泡沫更容易形成；反膠束提取的蛋白雖吸附在界面上的速度更快，但其肽鏈并不能快速伸展，并且產(chǎn)生互相作用進(jìn)而形成保護(hù)結(jié)構(gòu)，因此泡沫穩(wěn)定性較差。最新研究成果得出，反膠束法提取的核桃蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性，隨著核桃蛋白濃度增加逐漸提高[28]。曾有研究報(bào)道，反膠束所提取的脫脂小麥胚芽蛋白其起泡性及泡沫穩(wěn)定性都明顯高于堿溶酸沉淀法提取的蛋白，并且該蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性均高于蛋清標(biāo)準(zhǔn)，這也使其有望成為雞蛋蛋白的廉價(jià)替代品[29]。

反膠束法提取的植物蛋白具有更好的起泡性，但泡沫穩(wěn)定性不同植物蛋白有所差別。通過(guò)改變植物蛋白的萃取條件或方法，可以影響植物蛋白的起泡性及其泡沫穩(wěn)定性。研究不同植物蛋白萃取過(guò)程中影響其起泡性及穩(wěn)定性的因素，探索更多起泡性、泡沫穩(wěn)定性優(yōu)良的植物蛋白，可為植物蛋白在蛋糕類食物中的運(yùn)用提供新思路。

4.4 植物蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性

乳化性是蛋白質(zhì)主要的功能特性之一，乳狀液可以改變食品的口感，掩蓋不期望有的風(fēng)味，許多食物都是乳狀液品，如酸奶、沙拉醬、奶油等。因此，提高蛋白質(zhì)的乳化性能和乳化穩(wěn)定性以及應(yīng)用范圍一直是食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而蛋白質(zhì)的兩種乳化特性與其氨基酸組成、電荷分布、分子大小以及構(gòu)象有關(guān)。

李其昌等[7]研究發(fā)現(xiàn)，反膠束法提取的榛仁蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性較堿提酸沉法更好?？傮w的趨勢(shì)是，當(dāng)pH值小于5時(shí)，兩種乳化性質(zhì)隨著酸度增大而提高，當(dāng)pH值大于5時(shí)，隨著堿性增強(qiáng)，兩種乳化性質(zhì)提高。堿提酸沉法萃取的榛仁蛋白乳化性及其穩(wěn)定性較差，可能是因?yàn)閴A提酸沉法萃取的蛋白質(zhì)變性程度更高、溶解度更小。相關(guān)文獻(xiàn)表明，反膠束法提取核桃蛋白的乳化性及穩(wěn)定性在靠近等電點(diǎn)時(shí)出現(xiàn)最小值，而遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)隨之增強(qiáng)；并且隨著核桃蛋白濃度的增加其乳化性及穩(wěn)定性提高，這可能是因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)量濃度的增加，界面膜的厚度和強(qiáng)度也逐漸增大[30]。

由此可見，植物蛋白的兩種乳化性能均與其溶解性有關(guān)，等電點(diǎn)的溶解度最小，直接導(dǎo)致乳化性及穩(wěn)定性的下降，而反膠束提取的植物蛋白溶解性較好，所以其乳化性及穩(wěn)定性均勝于傳統(tǒng)提取方法。

5 結(jié)束語(yǔ)

反膠束提取技術(shù)在分離提純植物蛋白方面的優(yōu)勢(shì)顯而易見，但反膠束技術(shù)分離生物制品還面臨很多亟待解決的難題，如蛋白在分離過(guò)程中結(jié)構(gòu)與功能特性關(guān)系變化規(guī)律尚不清楚、表面活性劑和有機(jī)溶劑在蛋白中殘留的安全性問題、混合反膠束體系與新型生物表面活性劑的研發(fā)及應(yīng)用問題、優(yōu)化提取率及控制生產(chǎn)成本的問題等[2]。這些問題的解決，將有助于反膠束提取技術(shù)在食品加工行業(yè)中的運(yùn)用。基于反膠束提取技術(shù)在將來(lái)發(fā)展和應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)，反膠束提取的研究應(yīng)著力于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，著重研發(fā)新的反膠束萃取體系，使目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量、產(chǎn)率沿著最優(yōu)化方向發(fā)展。隨著反膠束提取技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，其研究及應(yīng)用將顯現(xiàn)巨大的潛在價(jià)值。