胡振陽 都立輝 袁 康 周 祺

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

黃曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)是一組化學結構類似的化合物，其基本結構為二氫呋喃環(huán)香豆素，前者為基本毒性結構單元，后者與致癌因素相關。目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20余種，主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最強[1]。4種黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)均具有高度肝毒性、腎毒性和免疫毒性，各國為避免動物、人類與其暴露接觸，全世界對AFT的污染情況進行全面監(jiān)管[2, 3]。

稻谷是最易受到黃曲霉毒素污染的糧油作物之一。吳芳等[4]測定了中國184個樣品中的黃曲霉毒素B1含量，發(fā)現(xiàn)貴州、云南、四川、廣西、江蘇等地黃曲霉毒素B1檢出率均在20%以上。有試驗[5]對100份大米樣品AFB1的污染情況進行評價， 78份糙米樣品中的12份樣品檢測到AFB1，9個城市中有3個城市大米檢出AFB1且不合格率約為5%。檢測分析我國長江三角洲地區(qū)76種糧油產(chǎn)品AFT后發(fā)現(xiàn)14.5%的樣品被檢測到AFB1，4.0%的樣品毒素濃度高于我國相應的限量標準[6]。雖然水稻并未立即被定義為一種高風險作物，但就黃曲霉毒素污染水平而言，稻谷及其制品存在地方性低mg/kg的AFB1污染[7]。

1 黃曲霉毒素的分子結構與毒性

黃曲霉毒素是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，20多種結構均為多環(huán)芳烴化合物[8]，根據(jù)其化學結構將其分為兩大類(見表1)：二呋喃香豆素環(huán)戊烯酮組：AFB1、AFB2、AFB2a、AFM1、AFM2、AFL、AFQ1)；二呋喃香豆素內酯組：AFG1、AFG2、AFG2a(見圖1)。其中，AFM1和AFM2是AFB1和AFB2的代謝產(chǎn)物。AFT是研究最為深入的真菌毒素之一，原因是其對家畜和脆弱的實驗動物有致癌和毒理作用，對人類有急慢性肝腫瘤和毒理作用。各種AFT毒性順序是AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFM2>AFG2，其中AFB1毒性最強，遠遠高于氰化物、鶴頂紅、三聚氰胺和有機農(nóng)藥，被世界衛(wèi)生組織認定為1A級危險物[9,10]，表2列出了AFB1對不同動物的半數(shù)致死量[11]。

AFB1具有明確的致癌性，導致嚴重肝損傷甚至肝癌，并對人體造成一系列其他生理損害：1)大劑量下引發(fā)急性毒作用甚至死亡；2)慢性亞致死劑量導致人體營養(yǎng)缺乏癥以及免疫系統(tǒng)損傷[12]。此外，黃曲霉毒素與其他致病因素對人類疾病的誘發(fā)具有疊加效應，據(jù)報道稱人類攝入AFB1后僅需24周即有致癌的風險，高AFT的飲食暴露接觸導致農(nóng)村人群患肝癌、腸癌等相關疾病的機率高于城市人群。當攜帶乙肝病毒患者暴露接觸AFB1后，患肝癌的風險約為正常人的60倍[10]。因此尋找有效的黃曲霉毒素的檢測、降解技術顯得尤為重要。文章綜述了近年來稻谷黃曲霉毒素的檢測與防控技術進展，旨為后續(xù)研究提供參考。

表1 黃曲霉毒素分類及結構[8]

表2 AFB1的半數(shù)致死量

表3 稻谷制品中黃曲霉毒素的色譜技術檢測方法

圖1 黃曲霉毒素的結構通式[8]

2 稻谷黃曲霉毒素的分離檢測技術

AFT的劇毒性及高致癌性要求必須對稻谷中是否含有AFT進行嚴格的檢測，AFT從20世紀末到21世紀初的定量分析方法取得了長足進展，主要方法有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫層析法(IC)等。

2.1 色譜檢測法

近年來，色譜法以其快速、高效、自動化程度高等優(yōu)點成為稻谷中黃曲霉毒素最常用的分析檢測方法。特別是色譜法同時定性定量、靈敏度高、選擇性高的優(yōu)點，大幅度促進稻谷黃曲霉毒素檢測手段的發(fā)展[13]。表3、表4分別列出了近年來稻谷制品中黃曲霉毒素的色譜技術檢測方法和稻谷中AFT分析檢測方法比較。

表4 稻谷中AFT分析檢測法比較

2.1.1 薄層層析法(TLC)

薄層色譜法在糧油的真菌毒素檢測中是一種的傳統(tǒng)的檢測技術，實驗過程耗時煩瑣且凈化效果不佳，易受雜質干擾，重現(xiàn)性差，屬于定性和半定量分析，目前僅作為化學分析中的一般佐證[17]，在稻谷黃曲霉毒素的檢測中被逐步淘汰。

2.1.2 液相色譜耦合熒光檢測器技術

液相色譜-熒光法因其熒光檢測器具有選擇性好、靈敏度高、信號強等特點，成為現(xiàn)階段實驗室最常用的AFT分析手段。由于AFB1和AFG1遇水會發(fā)生熒光淬滅，因此檢測前必須對毒素進行適當?shù)难苌磻蛊湫纬煞€(wěn)定的熒光活性衍生物。朱鵬飛等[15]建立了光化學衍生-高效液相色譜法測定糧谷類樣品中AFT的方法，該方法中AFB1、AFG1檢出限為0.15 ng/g，AFB2、AFG2檢出限為0.05 ng/g，加標回收率為89.5%～107%，精密度為1.4%～7.2%，其靈敏度和準確度較高，可適用于糧谷類食品中黃曲霉毒素的檢測。Zhou等[16]建立了熒光高效液相色譜免疫親和柱法測定大米中AFT的方法，對于具有顏色類的大米采用了表面活性劑提高回收率，AFT的回收率在75.2%～94.7%。由于柱前衍生法存在衍生物穩(wěn)定性差、反應時間長等缺點，李可等[17]對大米樣品建立無需衍生化檢測手段，該方法的AFT檢測限為0.04 μg/L，回收率達到86.8%～96.0%，且實驗周期短，操作簡單。

2.1.3 液相色譜質譜聯(lián)用技術

質譜是目前糧食制品中真菌毒素痕量分析檢測中使用最廣泛且最高效的檢測器，液相將質譜作為檢測器，黃曲霉毒素的分析檢測靈敏度和可靠性大幅提高[13]。Soleimany等[18]研究出一種同時測定谷物黃曲霉毒素的液相色譜串聯(lián)質譜法，平均回收率83.6%～108.1%，檢測限為0.25～0.6 μg/kg，該方法可用于稻谷及其制品中多組分真菌毒素污染物的痕量分析，能一并提供目標毒素化合物的保留時間和分子結構信息，適用于多組分分析，在多毒素同時檢測方面顯示出廣闊的應用前景。

2.2 免疫分析法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)

ELISA的優(yōu)點是反應特異性強、靈敏度高、干擾小、樣品預處理簡單、檢測結果準確且穩(wěn)定、成本低，現(xiàn)已成為快速檢測糧油中黃曲霉毒素最常見方法[26]。Jiang等[27]基于針對AFB1特異性單克隆抗體(MAb3C10)，開發(fā)并優(yōu)化了一種間接競爭性酶聯(lián)免疫吸附法，該法對稻谷中的AFB1的檢測限為0.52 μg/kg，平均回收率為73%～87%，相對標準偏差小于9%，是一種快速、簡單、可靠且可同時篩選不同食品基質中AFB1和AFM1的方法。

2.2.2 膠體金免疫層析法(GICT)

王督等[28]研制出一種AFB1膠體金免疫定量檢測卡，并建立大米、小麥等糧油產(chǎn)品中AFB1的定量分析方法將GICT與免疫親和柱凈化-HPLC法相比，相對誤差<15%，具有簡便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點，適用于稻谷及其制品中的AFB1篩查，樣品檢測時間只需15 min，且檢測成本低。為測試膠體金免疫層析試劑的適用性及便捷性，劉堅等[29]使用受AFB1污染的稻谷原始樣本，將高效液相色譜法和GICT測定方法進行對照研究，結果表明：兩種檢測手段的相符率在90.5%以上；而GICT成本低廉、操作簡單、快速且準確，可用于現(xiàn)場快速監(jiān)測和初篩稻谷制品中的AFB1。

2.2.3 時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)

張兆威等[30]利用自行研制的黃曲霉毒素時間分辨熒光免疫層析試紙條進行AFT檢測，以稻米等為例進行樣品檢測，AFB1的檢測限為0.3 μg/kg，線性范圍為0.8～15 μg/kg，與HPLC法相對誤差小于10%的檢測結果，說明TRFIA技術與行業(yè)標準檢測結果具有良好的一致性。TRFIA兼具時間分辨和波長分辨的特點，可有效的減少樣本的背景干擾，大幅度提高檢測的靈敏度?，F(xiàn)今為適應定量、便捷和快速檢測的要求，建立了真菌毒素檢測的時間分辨多組分分析法，為現(xiàn)場大通量快速篩選食品中的AFT建立一定技術基礎。

2.2.4 熒光共振能量轉移免疫分析(FRET)

由于FRET兼具均相反應高效、簡便、快速的優(yōu)點，無需額外的洗滌和分離步驟，Sabet等[31]用核酸適配體代替抗體，創(chuàng)新地將免疫學方法與生物傳感器技術相結合，開發(fā)了一種基于FRET的免疫傳感器檢測大米中AFB1的含量。該方法納米生物傳感器的檢測限為3.4 nm，線性范圍10～400 nm，并與AFB2、AFG2和AFM2等干擾物質均未有明顯的干擾效應。目前研究將FRET和免疫傳感器技術結合，使稻谷中黃曲霉毒素的檢測向自動化、高通量和微量化的方向發(fā)展。

3 稻谷黃曲霉毒素的防治技術

適當?shù)姆乐翁幚硎菧p輕與控制黃曲霉毒素危害的重要手段，主要是指除去、破壞及減少毒素作用的后期處理等。部分降解AFT物化脫毒情況見表5，生物脫毒方法包括微生物吸附和微生物降解等。AFT的部分微生物脫毒情況見表6。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定，AFT的脫毒工藝必須滿足以下條件：1)去除AFT或者使其失去活性；2)不產(chǎn)生任何有毒害的副產(chǎn)物；3)破壞產(chǎn)毒真菌孢子或菌絲體；4)食品或飼料脫毒后應保持其原有的適口性和營養(yǎng)價值[32]。

表5 部分降解AFT物化脫毒情況

表6 AFT的微生物脫毒情況

3.1 物理防治

物理防治技術是利用輻射、熱、光等物理手段抑制黃曲霉的生長及毒素的合成。其中光技術(如紫外線、脈沖強光、紅外輻射和微波輻射)具有無輻射污染、操作簡便、無二次污染、食用安全性高等特點，是最具工業(yè)化潛力的理想的防控技術。散裝貿易中的未加工谷物通常含有灰塵，收獲后的第一次稻谷產(chǎn)品加工往往涉及分揀、清洗或碾磨。最初，谷物先通過離心力和氣流中的浮選進行批量分選，之后建立起光學分類系統(tǒng)將顆粒流引導到一組光學傳感器上，當檢測到不同顏色的顆粒時，探測器會觸發(fā)一個電磁閥，一股壓縮空氣從氣流中排出內核以達到分選的作用，而且這一原理至今仍在使用[33]。農(nóng)民對谷物進行人工分類以及行業(yè)自動分揀，可顯著降低黃曲霉毒素的平均含量，此外對谷物銑削、浸泡和擠壓等進一步加工，霉菌毒素的含量也進一步降低，而研制大型工業(yè)化裝置，如物理挑選紫外照射和臭氧去除等裝置，以適用于稻谷等糧食行業(yè)現(xiàn)場工業(yè)化批量，更是一項艱巨的任務與挑戰(zhàn)。

3.1.1 微波輔助降解

微波降解是利用微波能量使目標物質分子高速旋轉，產(chǎn)生強烈的刺激作用并削弱其化學鍵直至斷裂，從而達到降解目標物的目的[34]。王勇等[35]在微波功率7.5 W/g和處理時間9 min的條件下對中AFB1的降解率達到98.5%，并且試驗證明該工藝能確保米蛋白產(chǎn)品安全無毒，還可提高米蛋白的部分品質。但是微波降解不易于大批量處理，同時會使物料不均勻受熱，對電能的消耗較大，所以在實際操作中難以規(guī)?；a(chǎn)。

3.1.2 輻射處理

輻射可分為電離輻射(X射線、紫外線、γ射線、電子束)和非電離輻射(微波、紅外、無線電波、可見光)，電子束輻射和脈沖強光技術是目前仍在探索黃曲霉毒素降解應用的新技術。

3.1.2.1 脈沖強光

脈沖強光技術降解作用在于其豐富的廣譜紫外含量、強烈的短時閃爍、高峰值功率以及調節(jié)閃光燈脈沖持續(xù)時間和頻率輸出的能力[36]。Wang等[37]對被脈沖強光處理過含有AFB1、AFB2的稻谷的副產(chǎn)品的毒性和誘變性進行測量，處理稻谷時，輻射通量為84.35 J/cm2的條件下，AFB1和AFB2分別降低75.0%和39.2%，處理米糠時，輻射通量為16.1 J/cm2的條件下，AFB1和AFB2分別降低90.3%和86.7%。但是，如果提高降解效率，在稻谷及其副產(chǎn)品中進行檢測，對降解產(chǎn)品進行安全性評價，還需要進一步的研究。

3.1.2.2 伽馬射線

Tamikazu等[38]在對稻米加工中產(chǎn)生的黃曲霉毒素的輻照效應進行研究，結果顯示：8 kGy可以殺死產(chǎn)毒曲霉菌；精大米中AFB1和AFG1輻射敏感性高于AFB2和AFG2，且輻照所需劑量達到500 kGy時，AFT才能被降解。朱佳廷等[39]采用γ射線(Co60)輻射稻米，4 kGy的輻照劑量下，降解率為42%，當輻照劑量為6 kGy時，降解率可達84%，γ射線輻照表現(xiàn)出對AFB1具有良好的降解效果。

3.1.2.3 電子束輻射(EBI)

電子束輻照技術通過高能脈沖直接破壞生物體細胞中的DNA，或間接輻射小分子和水物質，形成活性自由基，如—OH和—H，并與核內物質反應，產(chǎn)生交聯(lián)反應[40]。有研究表示EBI對玉米中的黃曲霉毒素具有良好的降解作用，但是作為一種新型技術還未對稻谷及其制品中的黃曲霉毒素表現(xiàn)出降解作用，也沒有被證明比伽馬輻射在降解AFT方面更有效[41]。

3.2 化學防治

化學防治是使用化學物質(如亞硫酸氫鈉、次氯酸鈉、檸檬酸等)來減輕或控制真菌毒素的危害。但經(jīng)化學處理后出現(xiàn)的安全問題更應重視，如降解產(chǎn)物自身仍具有毒性并對稻谷及其制品中風味和營養(yǎng)造成影響等[42]。

3.2.1 傳統(tǒng)的化學降解方法

臭氧是一種氧化性高于氯的強氧化劑，在水中有很強的氧化分解能力，可選擇性地與化學物質中雜原子發(fā)生反應，最終產(chǎn)生小分子物質，可通過破壞AFB1末端呋喃環(huán)的雙鍵來降低產(chǎn)物的毒性[43]。周建新等[44]優(yōu)化了臭氧處理稻谷降解AFB1的工藝條件，對1 000 g稻谷量采用臭氧處理濃度95 mL/m3，時間25 min，AFB1的降解率達到82.0%。Agriopoulou等[45]也相繼證實臭氧對AFT降解能力。然而，臭氧使制品營養(yǎng)缺失且不具有成本效益等缺點，致使其在稻谷用于降解黃曲霉毒素的應用有限。

3.2.2 天然精油

植物精油，也稱為揮發(fā)油，是植物體內一類次生代謝物，常溫下易揮發(fā)，具有特殊強烈的香味且香味成分穿透力強、持續(xù)時間長。植物精油中的某些氣相揮發(fā)成分具有生物活性，例如肉桂精油由于其內含大量具有揮發(fā)性的抗菌成分，因此能有效抑制黃曲霉菌毒素的產(chǎn)生和累積。植物精油來源廣泛且天然、生物降解性良好，毒性殘留極其微量，將其作為黃曲霉毒素形成抑制劑具有十分良好的應用前景[46]。姜黃精油對真菌生長及AFB1、AFG1的積累有明顯的抑制作用，并氣相色譜-質譜聯(lián)用分析表明，其主要成分為異松油烯、異丙基甲苯、α-水芹烯[47]。中國肉桂和月桂精油能夠AFB1、AFG1的積累，而芫荽精油不能抑制AFB1的積累[48]。

就目前對植物精油對稻谷中的黃曲霉毒素的積累影響試驗研究較少，所以從植物精油尋找和篩選有抑菌作用和使用安全性高的活性成分，同時為防止有毒成分對基質潛在影響造成二次污染，還需不斷完善精油及有效成分的毒理學分析和安全性評價，為稻谷及其制品安全食用提供保障[49]。

3.3 生物防治

生物防治是利用微生物在其生長過程的代謝產(chǎn)物或利用微生物自身的特征達到降解毒素的目的。依據(jù)生物防治技術原理，主要生物防治方法有：微生物吸附毒素和微生物代謝產(chǎn)物降解毒素，而選擇既具有降解能力又不破壞稻谷及其制品品質的酶或微生物是實現(xiàn)生物防治的關鍵[50]。

3.3.1 微生物吸附毒素

常用微生物吸附劑主要有：酵母菌、乳酸菌、霉菌菌絲體等。Wu等[51]發(fā)現(xiàn)AFB1被機體吸收后，代謝途徑明顯不同，產(chǎn)生無毒的化合物并導致劇毒活性物質的合成，酵母和乳酸菌可作為生物吸附劑阻止其進入人類和動物腸道。同時，AFB1與鼠李糖GG的結合降低黏附Caco-2細胞的能力，也表明細菌可能通過排泄毒素-菌體復合物來減少AFT在腸道中的積累[52]。同時毒素吸附過程是一個受限制的可逆過程，經(jīng)過反復水洗、過濾、加熱等作用會影響毒素-菌體復合物的穩(wěn)定性，使少量AFM1仍被洗脫下來[53]。有學者稱微生物種類、處理條件、環(huán)境等因素都會造成毒素-菌體復合物的穩(wěn)定性降低，加入有機溶劑或重復水洗都會使毒素再次洗脫出來[54]。

微生物吸附和物理吸附一樣，將黃曲霉毒素吸附在吸附劑的表面，降低受污染的樣品中毒素含量，但并不能從本質上脫除毒素的毒性。所以將基因工程與分子生物學相結合篩選及修飾微生物菌株變得更有必要，以便于應用于稻谷中實際生產(chǎn)。

3.3.2 微生物降解毒素

已從微生物系統(tǒng)中純化出能夠降解黃曲霉毒素的特定酶，特定酶的脫毒作用避免了微生物的缺點，微生物除具有除菌活性外，還會對稻谷風味造成影響并損害其營養(yǎng)價值和可接受性，而生物酶降解方式有著降解效率高、特異性強、不影響營養(yǎng)價值以及安全性高等優(yōu)勢[50]。

Motomura等[55]從平菇中分離純化了一種新的黃曲霉毒素降解酶，采用19株磨菇菌上清液熒光測定結果表明，其黃曲霉毒素的降解產(chǎn)物尚不清楚，但該酶能裂解AFT內酯環(huán)達到降解目的。在大多數(shù)情況下，解毒機制仍然不明，例如，Alberts等[56]從平菇、杏鮑菇等食用菌中產(chǎn)生的漆酶與黑曲霉重組對AFB1的降解率達到55%。到目前為止，歐盟還沒有授權任何酶來減少食品中霉菌毒素的污染，負責這些活動的酶是否適合工業(yè)生產(chǎn)還有待觀察。目前的研究表明，相對于物化降解AFT的方法，生物降解法具有安全無毒害、降解效率高、營養(yǎng)損失小等優(yōu)點，是以后防治AFT的重要研究方向。然而黃曲霉毒素雖能被不同的菌株所降解，但對脫毒物質的分離純化、降解產(chǎn)物的獲得以及毒理學研究相對較少，從培養(yǎng)上清液中去除黃曲霉毒素的新微生物不斷被描述出來,但往往缺少后續(xù)研究，同時存在菌株脫毒作用周期長、易受環(huán)境因素影響等問題。盡管所涉及的酶尚不清楚，但采用菌株進行脫毒防治頗具潛力，與食品加工中使用的所有微生物一樣，谷物中用于降低黃曲霉毒素的微生物菌株需要監(jiān)管機構的批準。對于目前脫毒降解研究存在的問題，筆者就未來可能防治AFT污染技術的研究，提出大致方向：1)微生物中抑菌物質的分離純化和功能基因序列的獲得；2)目前已獲得有效降解AFB1的脫毒酶的核酸序列，未來可通過有效的基因修飾手段和高效的分離純化工藝，利用基因工程的手段實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；3)利用分子生物學手段對產(chǎn)毒基因進行改造和修飾培育出不產(chǎn)毒的轉基因作物產(chǎn)品實現(xiàn)前期危害控制。

4 結論

黃曲霉毒素污染對人類健康構成嚴重威脅?，F(xiàn)今消費者敏銳地意識到食物對他們健康的重要性，消費者以前對食品安全的看法更偏向于具象型人造的污染物，但天然來源的有毒物質正漸漸受到關注。食品行業(yè)已然認識到這一趨勢，大力支持毒素降解方面的研究工作。新的物理和化學處理和新的解毒劑(微生物或純化酶)在經(jīng)過監(jiān)管批準上，必須對食品營養(yǎng)成分和感官品質的影響進行風險評估，毒素降解效果與營養(yǎng)物質的損失進行權衡。

黃曲霉毒素的消失不一定意味著完全被降解，若毒素被轉化為另外一種被檢出的形式，其仍具有毒性。大多情況下，黃曲霉毒素轉化的機制未得到充分的了解，產(chǎn)物沒有被定性，對毒素降解產(chǎn)物的毒理學研究僅限于體外和急性體內研究，導致此類研究提供的關于慢性低水平接觸安全性的信息不足。

現(xiàn)階段大多數(shù)關于霉菌毒素的研究集中在霉菌毒素上，即使是經(jīng)過充分研究的真菌代謝物也可能引起新的食品安全問題。基因組測序顯示，真菌污染食品有可能產(chǎn)生30～60種次生代謝物，其中一些可能會被證明為新的霉菌毒素。一旦評估了新發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素的毒性和暴露水平，就必須根據(jù)新發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素調整降解方案。同時，筆者在調研時還發(fā)現(xiàn)：全球普遍存在AFT與其他類型霉菌毒素(如赭曲霉毒素、嘔吐毒素)在稻谷中共存的現(xiàn)象，對黃曲霉毒素的解毒機制和聯(lián)合毒性作用的研究也將會成為未來科研工作的重要方向。