劉 奇 張 智

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040)

玉米肽(Corn peptide，CP)是一種具有特定空間結(jié)構(gòu)和功能活性的短肽聚合物[1，2]。研究表明CP具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶[3，4]、降低血壓[5]、促進(jìn)乙醇代謝、醒酒護(hù)肝[6]以及抗氧化[7-10]、緩解疲勞[11]、抗癌[12]等功能。張智[13]等以玉米肽為參照研究玉米肽-鋅(CP-Zn)螯合物的結(jié)構(gòu)表征和體內(nèi)抗氧化活性變化，結(jié)果表明CP-Zn的抗氧化活性優(yōu)于CP，且能顯著降低小鼠血清、肝臟中丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶的活力。香菇多糖是一種新資源功能活性物質(zhì)，研究表明香菇多糖具有抗氧化、抗腫瘤[14]提高機(jī)體免疫功能等生物活性[15-18]，若能利用香菇多糖結(jié)合玉米肽制成具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，功能活性較強(qiáng)的玉米肽-香菇多糖螯合物，并將其應(yīng)用于功能食品的開(kāi)發(fā)中將有廣泛發(fā)展前景。

因此，本研究利用玉米肽-香菇多糖螯合物(CPG)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。以CP及香菇多糖(G)為參照，將健康小鼠分為正常對(duì)照組；玉米肽低、中、高劑量組；玉米肽-香菇多糖低、中、高劑量組；香菇多糖低、中、高劑量組，通過(guò)小鼠生長(zhǎng)性能(體重增長(zhǎng)率、免疫器官指數(shù))、體液免疫能力(巨噬細(xì)胞增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬能力、免疫球蛋白水平)、細(xì)胞免疫能力(淋巴細(xì)胞增殖能力、淋巴細(xì)胞周期)等方面進(jìn)行分析其免疫功能活性，為CPG的應(yīng)用及玉米加工副產(chǎn)物綜合利用等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

雄性SPF小鼠(20±2)g 6～8 周齡，合格證號(hào)SCXK黑2013-004：黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥物評(píng)價(jià)中心；玉米肽(純度87.83%)、香菇多糖(純度89.62%)。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

WST-1 細(xì)胞培養(yǎng)液，印度墨汁(生物染色劑)，DNFB(優(yōu)級(jí)純)，Na2CO3(分析純)，PBS緩沖液，碘化丙啶，RNA 酶，多酚，胰酶，免疫球蛋白IgA、IgG試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

HF-90 CO2恒溫培養(yǎng)箱；AE31倒置顯微鏡；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)；MEK-7222血細(xì)胞分析儀；MULTISKAN MK3型酶標(biāo)儀；LEICA RM2235石蠟切片機(jī)；101-1型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱；BD-326型臥式冷凍冰柜。

1.3 方法

1.3.1 玉米肽-香菇多糖修飾產(chǎn)物的制備

將CP(通過(guò)Sephadex G-25分級(jí)得到肽段，平均分子質(zhì)量為572 u，肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)80.01%)配制成底物濃度為4%的溶液，調(diào)節(jié)pH值至7，取50 mL玉米肽溶液，按投料比為8∶1的比例加入香菇多糖(香菇多糖平均分子質(zhì)量1 029 D，主要成分為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等)供體，再次調(diào)節(jié)pH值至7，60 ℃水浴40 min，冷卻后4 500r/min離心10 min；流水透析24 h，冷凍干燥得到最終修飾產(chǎn)物玉米肽-香菇多糖(CPG)[15,19]。經(jīng)檢測(cè)，組分中氨基酸總量為70.25%(主要成分為谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸等)，玉米肽-香菇多糖螯合率為69.69%，CPG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60.17%。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，稱量小鼠體重，將小鼠按照體重指標(biāo)隨機(jī)分為10組，每組12只，采用基礎(chǔ)飼料飼喂，自由飲水，給藥劑量每只0.2 mL，具體給藥方法如下表。根據(jù)體重差異進(jìn)行每組每天灌胃給藥，連續(xù)灌胃給藥30 d后處死，每組3次重復(fù)。給藥劑量根據(jù)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法-2003》擬定[19]，動(dòng)物飼養(yǎng)和處理遵循中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)(CALAS)的規(guī)定。

表1 功能實(shí)驗(yàn)分組

1.3.3 小鼠生長(zhǎng)性能的測(cè)定

停藥后隔日處死小鼠，稱取小鼠體重、脾臟、胸腺分別脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

脾臟指數(shù)=脾臟(g)/體重(g)×100%

(1)

胸腺指數(shù)=胸腺(g)/體重(g)×100%

(2)

1.3.4 小鼠體液免疫能力的測(cè)定1.3.4.1 小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力的測(cè)定[20]

末次給藥1 h后處死動(dòng)物，75%酒精浸泡5 min，無(wú)菌環(huán)境中取出腹腔巨噬細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，取細(xì)胞沉淀，加4 mL紅細(xì)胞裂解液吹打均勻，室溫靜置5 min后，1 000 r/min離心5 min，取沉淀采用4 mL PBS洗滌3遍，重懸中含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，然后按5×106/孔接種于6孔板進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞按照1×104/孔密度接種于96孔板，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行培養(yǎng)12 h后，采用WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖，將各組細(xì)胞加入20 μL WST-1溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h后，將96孔板置于搖床上搖動(dòng)1 min，以充分混勻待檢測(cè)體系，以酶標(biāo)儀波長(zhǎng)630 nm作為參考波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.4.2 小鼠吞噬能力的測(cè)定[20]

按每10 g體重0.1 mL的劑量向小鼠尾靜脈注射印度墨汁(10 mg/kg)，注射開(kāi)始時(shí)計(jì)時(shí)，分別在2 min和10 min時(shí)取眼血20 μL于3 mL0.1%的Na2CO3溶液中，在600 nm處測(cè)定吸光值(OD)，以0.1%的Na2CO3溶液作為空白對(duì)照。將小鼠脫臼處死，取肝臟及脾臟并分別稱重，按公式計(jì)算吞噬指數(shù)a。

(3)

式中：a為吞噬指數(shù)；m0為小鼠體重/g；m1為小鼠肝重/g；m2為小鼠脾重/g；OD1為2 min時(shí)吸光值；OD2為10 min時(shí)吸光值。

1.3.4.3 小鼠免疫球蛋白水平的測(cè)定

免疫球蛋白測(cè)定參照IgA、IgG試劑盒說(shuō)明。

1.3.5 小鼠細(xì)胞免疫能力的測(cè)定

1.3.5.1 小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的測(cè)定

同1.3.4.1操作。

1.3.5.2 小鼠淋巴細(xì)胞周期的測(cè)定[21]

染色液配制：用0.01 mol/L pH 7.2的PBS緩沖液溶解1.00 mg 碘化丙啶(PI)和1.00 mg RNA 酶，配制成含100 μg/mL PI和100 μg/mL Rnase A的染色液，在-20 ℃下避光保存。

細(xì)胞周期檢測(cè)：無(wú)菌條件下取出小鼠脾臟按照細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)方法，用不同濃度的多酚處理后，用0.25%胰酶消化并將脾臟充分吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，將細(xì)胞收集于1.5 mL無(wú)菌離心管中，4 ℃ 以2 000 r/min離心5 min，用PBS緩沖液將細(xì)胞洗滌2次，離心5 min后，棄去PBS溶液，加入預(yù)冷的75%乙醇2 mL，重懸細(xì)胞，放入4 ℃冰箱內(nèi)固定24 h。

上機(jī)前將固定細(xì)胞以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去固定液，加入pH 7.2的PBS緩沖溶液重懸細(xì)胞，離心5 min，棄PBS緩沖液，加入含100μg/mL PI和100 μg/mL Rnase A的染色液，4 ℃避光染色30 min后，使細(xì)胞分散后于74 μm篩網(wǎng)過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Excel軟件進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPG對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

2.1.1 CPG對(duì)體重指數(shù)的影響

CP、CPG、G對(duì)小鼠體重的影響見(jiàn)圖1。與正常組相比，CP-H和CPG-M、CPG-H均能顯著提高小鼠體重水平。這表明CPG和CP均能提高小鼠的體重增長(zhǎng)率，但CP需要在高劑量的水平下才能達(dá)到顯著效果。

注：不同字母表示差異顯著P<0.05，下同。圖1 CP、CPG、G對(duì)小鼠體重的影響

2.1.2 CPG對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

胸腺是重要的中樞免疫器官，其主要功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺素，參與細(xì)胞免疫；脾臟是外周免疫器官，具有豐富的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，但B淋巴細(xì)胞比例較大，與體液免疫關(guān)系更為密切，因此胸腺、脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，而其臟器指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。由圖2可知，與空白組相比，CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H、G-M、G-H組均能顯著(P<0.05)提高免疫器官指數(shù)，且CPG較CP組的效果更加明顯。CP、CPG、G均能顯著提高小鼠的生長(zhǎng)性能指數(shù)，且CPG較CP組效果更加顯著。

圖2 CP、CPG、G對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

2.2 CPG對(duì)小鼠體液免疫的影響

2.2.1 CPG對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力的影響

CP、CPG、G對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力的影響見(jiàn)圖3。細(xì)胞增殖指細(xì)胞經(jīng)過(guò)DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等反應(yīng)而進(jìn)行的分裂過(guò)程，是生命體的重要特征。RAW264.7 細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的一種，當(dāng)病原體入侵或自身組織出現(xiàn)病理性改變時(shí)，它能激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)殺傷作用消滅抗原[20]。由圖3可知，與正常組相比，CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H，G-M、G-H均能顯著(P<0.05)提高小鼠巨噬細(xì)胞的增殖能力，且CPG的效果要優(yōu)于CP和G。

圖3 CP、CPG、G對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力的影響

2.2.2 CPG對(duì)小鼠吞噬能力的影響

CP、CPG、G對(duì)小鼠吞噬能力的影響見(jiàn)圖4。吞噬能力指巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬侵入的病原體及體內(nèi)衰老、畸變的細(xì)胞而提高機(jī)體的免疫能力。在小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)中，體內(nèi)碳顆粒被清除的速率與血碳濃度呈指數(shù)關(guān)系，且動(dòng)物的脾臟、肝影響機(jī)體的吞噬速率，其吞噬能力的大小可以間接反映機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬能力，可以在一定程度上體現(xiàn)出機(jī)體的非特異性體液免疫水平[22]。由圖4可知，與正常組相比，CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H、G-H劑量組均能顯著(P<0.05)提高小鼠的吞噬能力，且CPG的效果要優(yōu)于CP和G-H。這表明CP、CPG、G均能顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞的增殖能力和吞噬能力，且和劑量呈現(xiàn)正相關(guān)，從而發(fā)揮提高機(jī)體體液免疫的生物學(xué)功能。

圖4 CP、CPG、G對(duì)小鼠吞噬指數(shù)的影響

2.2.3 CPG對(duì)小鼠免疫球蛋白水平的影響

CP、CPG、G對(duì)小鼠免疫球蛋白水平的影響見(jiàn)圖5。免疫球蛋白是指具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋白，一般存在于血液及某些細(xì)胞的表面上，血清免疫球蛋白的測(cè)定是檢查體液免疫功能最常用的方法。IgG是血清主要的抗體成分，約占血清Ig的75%，其主要在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用[23]。IgA分血清型和分泌型兩種，血清型IgA可介導(dǎo)調(diào)理吞噬ADCC作用；分泌型IgA(SIgA)是機(jī)體粘膜防御系統(tǒng)的主要成分，它能抑制微生物在呼吸道上皮附著，減緩病毒繁殖，是防止病原體入侵機(jī)體的第一道防線。由圖5可知，與正常組相比，CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H顯著(P<0.05)提高機(jī)體免疫球蛋白IgA水平；CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H、G-H均能顯著(P<0.05)提高機(jī)體免疫球蛋白IgG。

圖5 CP、CPG、G對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

2.3 CPG對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的影響

2.3.1 CPG對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

CP、CPG、G對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響見(jiàn)圖6。T淋巴細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，當(dāng)外界應(yīng)激源和腫瘤細(xì)胞抗原接觸T細(xì)胞時(shí)，會(huì)刺激T細(xì)胞增殖、分化成效應(yīng)T細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞免疫和抗腫瘤反應(yīng)[24]，因此，淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是反映機(jī)體免疫狀態(tài)的一種實(shí)驗(yàn)。由圖6可知，與正常組相比，CP-H和CPG-M、CPG-H、G-H能顯著(P<0.05)提高小鼠巨噬細(xì)胞的增殖能力。這表明CP、CPG、G都能促進(jìn)機(jī)體的淋巴細(xì)胞增殖能力進(jìn)而達(dá)到提高機(jī)體細(xì)胞免疫水平。

圖6 CP、CPG、G對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

2.3.2 CPG對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞周期的影響

CP、CPG、G對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞周期的影響見(jiàn)圖7。淋巴細(xì)胞增殖是機(jī)體發(fā)揮細(xì)胞免疫的重要途徑，當(dāng)淋巴細(xì)胞與抗原或有絲分裂因子(簡(jiǎn)稱為絲裂原)在體外共同培養(yǎng)轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，并且分裂增殖生成更多的淋巴細(xì)胞進(jìn)行發(fā)揮細(xì)胞免疫[25]。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CP-H和CPG-H、G-H高劑量組具有最佳的生物活性能，因此，此處主要采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)空白對(duì)照組、CP-H高劑量組與CPG-H和G-H的脾淋巴細(xì)胞分布情況。識(shí)別DNA損傷的關(guān)鍵是G1、S期和G2/M等周期檢查點(diǎn)。由圖7可知，空白對(duì)照組、CP-H劑量組與CPG-H、G-H劑量組的G0/G1期比例分別為92.42%、88.47%、87.88%、89.56%；S期比例分別為2.77%、4.13%、4.41%、3.31%；G2/M比例分別為3.18%、7.99%、9.70%、4.98%。CP-H劑量組、CPG-H、G-H劑量組與空白對(duì)照組相比G1分別減少了3.95%、4.54%、2.48%；S期分別增加了1.36%、1.64%、1.15%，這說(shuō)明CPG較CP、G更能促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，有利于DNA的合成，提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖分化能力。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞周期分布

3 結(jié)論

利用玉米肽-香菇多糖螯合物(CPG)進(jìn)行小鼠體內(nèi)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：CP、CPG、G能顯著提高小鼠生長(zhǎng)性能，且CPG組較CP和G組能顯著提高免疫器官指數(shù)，對(duì)免疫器官發(fā)育的促進(jìn)作用要優(yōu)于CP；CP高劑量組、CPG低中高劑量組、G高劑量組均能顯著(P<0.05)提高小鼠體液免疫能力，增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的增殖能力、吞噬能力，提高免疫球蛋白IgA和IgG水平，這表明CPG對(duì)機(jī)體體液免疫能力的提升作用要優(yōu)于CP和G；小鼠細(xì)胞免疫能力方面，CP和CPG均能促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力，且CPG較CP更能促進(jìn)有絲分裂，不影響阻滯細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，有利于DNA的合成，提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖分化能力。研究表明CPG對(duì)機(jī)體的免疫增強(qiáng)效果要優(yōu)于CP，其可以通過(guò)促進(jìn)小鼠機(jī)體生長(zhǎng)性能、體液免疫能力水平、細(xì)胞免疫能力水平發(fā)揮其免疫生物學(xué)活性。