沙 敏 桂冬冬 張正勇 吉昕妍 蔣丙晨 劉 軍 張 丁

(南京財經(jīng)大學(xué)管理科學(xué)與工程學(xué)院1，南京 210023)

(南京理工大學(xué)化工學(xué)院2，南京 210094)

中國是世界上100多個水稻生產(chǎn)國中的“稻米王國”，我國約60%的人口以稻米為主食[1]。根據(jù)GB/T 1354—2018，大米按原料稻谷類型分為秈米、粳米和糯米3類。大米間化學(xué)成分的含量和糊化等理化特性有較大的差異[2]，因而食味品質(zhì)差別明顯[3-5]，只有某些秈米品種才能制作出品質(zhì)優(yōu)良的米粉[6]，現(xiàn)階段稻米食品加工原料的選擇大多憑經(jīng)驗，盲目性較大，食品品質(zhì)難以得到保證。隨著物質(zhì)生活水平提高，人們消費需求已從“要吃飽”轉(zhuǎn)為“要吃好”，促使水稻生產(chǎn)從重“量”轉(zhuǎn)向重“質(zhì)”。中國在稻作栽培和稻作育種都是秈粳并重的國家[7]，對于秈粳稻的雜交育種，如果對秈粳稻的特征特性認(rèn)識不深，會導(dǎo)致測配選親本困難及測配結(jié)果不理想，甚至育成品種亞種特性較典型秈粳型的變化，遺傳規(guī)律及與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系等難以確定。此外，早秈稻因生長期雨水充沛、病蟲害少、災(zāi)害性天氣不多，因此化肥、農(nóng)藥的施用量相對較少，故質(zhì)量安全、品質(zhì)明顯高于粳稻和中晚稻，營養(yǎng)價值好[8]。因此，正確地了解秈粳分類和判別秈粳是秈粳稻產(chǎn)品加工和雜交育種等急需研究的問題[9]。

目前，在栽培稻秈粳亞種的分類鑒別中得到應(yīng)用的方法有感官評價法、形態(tài)指數(shù)鑒定法、雜交親和力鑒定法、同工酶基因數(shù)量化鑒定法、DNA分子標(biāo)記鑒定法、氯酸鉀抗性鑒定法、機(jī)動細(xì)胞硅酸體形態(tài)性狀鑒定法、雙峰乳突鑒定法等[3]。感官評價法鑒別大米種類不僅對鑒別的環(huán)境要求高而且主觀因素干擾大[10]。形態(tài)指數(shù)鑒定法、同工酶基因數(shù)量化鑒定法、DNA分子標(biāo)記鑒定法、機(jī)動細(xì)胞硅酸體形態(tài)性狀鑒定法等方法需要收集多個指標(biāo)形狀進(jìn)行分類。雜交親和力鑒定法受環(huán)境尤其是溫度的影響較大。且這些方法均需要一定的軟硬件條件支撐，操作煩瑣，耗時費力。因此，急需一種準(zhǔn)確度高、快速高效、成本低的大米種類鑒別方法。

大米的化學(xué)成分與大米種類及生長環(huán)境的關(guān)系非常密切，且含量具有可定量、相對穩(wěn)定的特點[11]。然而化學(xué)成分相對復(fù)雜，用單一或若干組分的信息難以鑒別產(chǎn)品[12]，通常采用能夠反映整體信息的指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法[13,14]。拉曼光譜法因具有靈敏度高、操作簡便、測試時間短、無損分析等優(yōu)點，近年來逐步被用于大米的新陳鑒別、轉(zhuǎn)基金鑒別、產(chǎn)地鑒別和摻假鑒別分析[15-19]，但在大米種類鑒別方面的應(yīng)用稀少。江南大學(xué)張輝課題組先后用Lab RAM HR Evolution型顯微共聚焦拉曼光譜儀采集大米拉曼光譜，然后結(jié)合SIMCA和PLSDA 2種模式識別方法建立粳米、秈米、糯米分類鑒別模型，識別準(zhǔn)確率均大于96%[20,21]。這些研究在采集大米指紋圖譜時，對大米直接進(jìn)行測試，而大米內(nèi)外成分不一[22]，且加工工藝如拋光等會導(dǎo)致大米表面成分的差異，因而，僅采集大米表面的拉曼光譜不足以反映大米的整體成分信息。Sha等[23]研究了大米粉碎粒度對拉曼光譜的影響，發(fā)現(xiàn)粉碎粒度為100～140目米粉的拉曼光譜間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最小，相似度最高，該粒度下米粉的均勻性最佳，所得拉曼光譜的穩(wěn)定性最高，可為大米分析提供穩(wěn)定、可靠的數(shù)據(jù)源。

本研究利用便攜式拉曼光譜分析技術(shù)，采集粉碎粒度為100～140目米粉的拉曼光譜，借助模式識別方法海量提取大米拉曼光譜信息，建立大米種類簡單、快速、準(zhǔn)確的分類鑒別模型，以期為檢測水稻種類提供借鑒，并最終幫助消費者選擇所需種類和質(zhì)量的大米。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗共采集72份大米樣品，均為常規(guī)稻，包括秈米28份(湖北9份、云南10份、海南9份)；粳米25份(江蘇10份、黑龍江10份、吉林5份)；糯米 19份(湖北5份、安徽9 份、云南5份)，生產(chǎn)日期為2018年。

1.2 儀器與設(shè)備

Prott-ezRaman-d3便攜式激光拉曼光譜儀，激光波長785 nm；15B型立式粉碎機(jī)自帶篩網(wǎng)網(wǎng)孔直徑為0.6 mm；石英樣品池(定制，長4 cm，寬2 cm，厚3 mm，正中央圓形凹槽直徑1.5 mm，深度2 mm)；篩子(100目和140目)。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取每份大米20 g，待粉碎機(jī)預(yù)熱運(yùn)行1 min后，在30 s內(nèi)緩慢加入大米，再粉碎2 min，確保大米粉碎完全。米粉依次經(jīng)100目和140目篩進(jìn)行顆粒分級，收集粒度為100～140目的米粉，用于后續(xù)譜圖測試。

1.3.2 拉曼光譜譜圖測試

經(jīng)前期大量拉曼測試條件優(yōu)化實驗得峰形佳、峰強(qiáng)度高且樣品無明顯熱損失的最佳拉曼光譜采集參數(shù)如下：功率450 mW，CCD檢測器 -85 ℃，掃描范圍250～2 339 cm-1，分辨率1 cm-1，曝光時間4 s，掃描次數(shù)3次，激光與樣品表面的距離5 mm。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

為了降低實驗儀器的噪聲干擾，基于MATLAB 2016a平臺利用wden小波函數(shù)對拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行小波去噪，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理，然后分別采用主成分分析(PCA)[24-26]、層次聚類分析(HCA)[27-29]和支持向量機(jī)(SVM)[30-32]3種方法進(jìn)行分析。主成分分析以得分矩陣中的特征主成分(PC1，PC2，PC3)投影到三維空間坐標(biāo)系中，利用三維坐標(biāo)系中各模式點的分布進(jìn)行分類與判別。聚類分析采用凝聚的層次聚類分析方法，其中，距離度量的方法采用歐氏距離、標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離、城市街區(qū)距離和余弦距離，創(chuàng)建系統(tǒng)聚類樹的方法使用平均距離法、最短距離法和最長距離法。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種大米的拉曼光譜分析

分別以秈米中的遮放貢米(ZF)、粳米中的七星粳米一號(JSJ)和糯米中的白蓮坡糯米(NA)作為3種大米的典型，粉碎后取粒度在100～140目的米粉測試?yán)庾V。經(jīng)wden小波去噪和mapminmax歸一化預(yù)處理后的拉曼光譜圖如圖1所示，整體上看3種大米的拉曼光譜高度相似，峰的信號主要出現(xiàn)在250～1 500 cm-1范圍內(nèi)，因此后續(xù)分析均只考慮該波段內(nèi)的數(shù)據(jù)。

圖1 3種大米的拉曼光譜圖

盡管高度相似，但3種大米在部分波段范圍內(nèi)有肉眼可見差異。以每個產(chǎn)地1個大米為代表，共9種大米的拉曼光譜對照圖如圖2所示，其中，實線代表糯米，短劃線代表秈米，點劃線代表粳米。糯米在425、455、1 410 cm-1附近區(qū)域內(nèi)的吸收峰強(qiáng)度明顯高于粳米和秈米，但在1 450 cm-1附近的光強(qiáng)卻低于其他2種米，根據(jù)朗伯-比耳定律，糯米與其他2種米的部分成分含量差異略大。在455 cm-1附近區(qū)域，3種大米的最大吸收光強(qiáng)對應(yīng)的波長位置有明顯差異，說明這3種大米的部分成分在結(jié)構(gòu)上存在差異。在1 410 cm-1附近區(qū)域，3種大米的吸收峰形狀有明顯差異，糯米和粳米的吸收曲線有明顯峰頂，秈米的吸收曲線則較平滑，這些信號的差異給用拉曼光譜鑒別大米種類提供了可能。

圖2 拉曼光譜局部放大圖

2.2 PCA

3種大米的72個拉曼光譜數(shù)據(jù)依次去噪、歸一化處理后經(jīng)主成分分析，前15個主成分的貢獻(xiàn)率如圖3所示，累計貢獻(xiàn)率達(dá)85.41%。其中，第一主成分解釋了27.53%的原始信息，第二主成分解釋了23.30%的信息量，第三主成分解釋了10.34%的信息量，前3個主成分的累計貢獻(xiàn)率為61.17%，包含了拉曼光譜數(shù)據(jù)大部分的信息。

圖3 前15個主成分的貢獻(xiàn)率圖

將72個樣本投影到以得分矩陣中的前3個特征主成分(PC1、PC2、PC3)構(gòu)成的三維空間坐標(biāo)系中(見圖4)。可見秈米和糯米分布在粳米兩側(cè)，聚類特征較為明顯，秈米和糯米可明顯區(qū)分開。而粳米與秈米、粳米與糯米樣本間分布區(qū)域有一定的重疊，較難實現(xiàn)精確分類。PCA分析可直觀反映2種大米的相似程度，但三者之間分類界限不明顯，還需要進(jìn)一步建立相關(guān)的模型進(jìn)行判別。

圖4 3種大米PCA分析圖

進(jìn)一步地，根據(jù)前3個主成分的載荷圖(圖5)分析粳米、秈米、糯米分類的主要特征波段，可以得出420～560 cm-1、860～980 cm-1、1 000～1 200 cm-1、1 300～1 500 cm-1對粳米、秈米和糯米分類的貢獻(xiàn)較大。該結(jié)果與圖2肉眼可見拉曼光譜差異波段相比較基本吻合，多了860～980 cm-1波段，說明模式識別方法具備高效的特征提取和數(shù)據(jù)分析能力，可揭示指紋圖譜數(shù)據(jù)中的隱含信息。據(jù)文獻(xiàn)報道[20]，這些差異來源如表1所示，可知3種大米可區(qū)分的關(guān)鍵成分為蛋白質(zhì)和淀粉，與文獻(xiàn)[9]所述大米的主要成分差異一致?？傊竺椎睦庾V是多種成分的綜合反映，每個譜帶的強(qiáng)度、位置和寬度變化是由于不同組分的含量和微觀結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致的。

圖5 前3個主成分的載荷圖

表1近似峰值及其對應(yīng)的基團(tuán)及振動形式[20-21]

近似峰值/cm-1基團(tuán)及振動形式1 458C—H彎曲1 452CH2(或CH3)變形1 440～1 320C—O—H彎曲1 391,905支鏈淀粉1 360色氨酸1 342CH2扭曲1 314CH2搖擺1 253,850直鏈淀粉1 200～1 000C—O—H拉伸1 155C—C拉伸1 132,1 082,1 037,941α-環(huán)狀糊精1 032脯氨酸1 004苯丙氨酸920～960α-和β-糖苷鍵的不同振動525S—S伸縮振動439,476,576淀粉中葡萄糖單元

圖6 三種大米的聚類樹圖

2.3 HCA

數(shù)據(jù)經(jīng)去噪、歸一化及特征提取處理后，經(jīng)HCA分析。分別使用不同的距離度量和不同的創(chuàng)建系統(tǒng)聚類樹的方法，計算它們之間的同表象型相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表2所示，同表象型相關(guān)系數(shù)最大值為0.810 4，對應(yīng)的距離度量是標(biāo)準(zhǔn)歐氏距離，創(chuàng)建系統(tǒng)聚類樹的方法是平均距離法，所創(chuàng)建的聚類樹的樹狀圖如圖6所示。

表2 不同聚類樹創(chuàng)建方法的同表象型相關(guān)系數(shù)

圖中，樣本編號1～28為秈米，29～47為糯米，48～72為粳米。糯米樣本分布在A區(qū)內(nèi)，除了29號和31號樣本之外全部歸在一簇，可與秈米和粳米很好的區(qū)分開。其中，29號樣本混在秈米樣本簇中，31號樣本自成1簇。粳米的25個樣本聚成了2簇，其中1簇(B區(qū)域，8個樣本)與秈米混在一起，另1簇與糯米比較類似(A區(qū)域)，說明粳米與秈米和糯米均有一定的相似性，這一結(jié)果與前述PCA結(jié)果一致。秈米樣本分布在B區(qū)內(nèi)，除了19、26和28這3個樣本外聚成了2簇，且這3個樣本均混在A區(qū)的粳米簇中，說明粳米和秈米部分樣本相似度較高，使用HCA方法容易誤判。綜上，HCA方法與PCA方法類似，也可直觀反映3種大米間的差異情況，相較PCA而言，HCA可進(jìn)一步對樣本進(jìn)行分類判別，如上分析，3種大米錯誤判別的樣本數(shù)為糯米2個、秈米3個、粳米8個，歸類準(zhǔn)確率為81.94%，可見HCA方法判別準(zhǔn)確率偏低。

2.4 SVM

為了提高識別準(zhǔn)確率，引入支持向量機(jī)建立智能識別模型。采用隨機(jī)函數(shù)隨機(jī)選取37個樣本作為訓(xùn)練集來訓(xùn)練模型(秈米14個，粳米13個，糯米10個)，剩余的樣本(秈米14個，粳米12個，糯米9個)作為驗證集樣本驗證所建模型的準(zhǔn)確性。以RBF為核函數(shù)，懲罰參數(shù)C和核參數(shù)g的尋優(yōu)使用網(wǎng)格搜索法，具體參數(shù)設(shè)置：C的變化范圍限定為[2-10，25]，g的范圍取[2-10，2]，進(jìn)行5折交叉驗證，C和g的步進(jìn)值均為0.5，最后參數(shù)選擇結(jié)果圖中準(zhǔn)確率離散化顯示的步進(jìn)值為4.5。為提高模型的可靠性，將隨機(jī)運(yùn)行10次的平均值作為模型的識別準(zhǔn)確率，結(jié)果如表3所示，模型平均識別率為98.86%，優(yōu)于HCA方法(81.94%)。

表3 10次運(yùn)行準(zhǔn)確率

3 結(jié)論

為實現(xiàn)3種大米的準(zhǔn)確、快速鑒別，從全國粳米、秈米和糯米的主產(chǎn)區(qū)分別選購72份大米樣品，包括秈米28份、粳米25份和糯米19份，大米經(jīng)粉碎取100～140目的米粉，采集米粉的拉曼光譜，依次對譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪、歸一化和特征提取后，綜合運(yùn)用主成分分析、層次聚類分析和支持向量機(jī)3種方法對粳米、秈米和糯米進(jìn)行聚類與模式識別研究。拉曼光譜數(shù)據(jù)經(jīng)PCA降維分析，可直觀地將3種大米歸為3簇，秈米和糯米可被區(qū)分開，但粳米與糯米、粳米與秈米不能區(qū)分。HCA分析表明粳米與秈米較難區(qū)分，糯米與其他2種米有較大差異，但3種大米的歸類準(zhǔn)確率為81.94%，鑒別效果不理想。SVM判別方法10次運(yùn)行的平均識別率達(dá)98.86%。實驗證明：拉曼光譜法結(jié)合支持向量機(jī)用于大米種類的分類與識別簡單快速，在分析數(shù)據(jù)相對復(fù)雜的情況下，可快速建立分類模型并實現(xiàn)大米種類間的鑒定與識別。此外，拉曼光譜分析使用的是便攜式拉曼光譜儀，本研究成果在現(xiàn)場快速檢測上具有良好的應(yīng)用前景。