楊 柳 王朝仁 楊黎耀 柴振林 秦玉川 王衍彬

(浙江省林產(chǎn)品質(zhì)量檢測站1，杭州 310023)

(浙江省林業(yè)科學(xué)研究院2，杭州 310023)

大豆油、花生油、油茶籽油等植物油是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡闹匾巢模洚a(chǎn)品質(zhì)量安全越來越受消費者關(guān)注，特別是近年來涉油的食品安全事件頻發(fā)，如“金浩茶油”[1]“地溝油”[2-4]“老油油條”[5,6]等事件，讓人談油變色。有關(guān)部門已高度重視，并制定相應(yīng)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[7,8]，其中黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1簡寫為AFTB1)便是其重要的衛(wèi)生指標(biāo)。目前關(guān)于AFTB1檢測方法的研究報道已比較多，主要有液相色譜-熒光檢測器法[12,13]、液質(zhì)聯(lián)用法[14-16]、薄層色譜法[17]等。其中薄層色譜法由于定量精度相對較差、操作難度大，已較少采用。高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜、超高壓液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測限較低，但設(shè)備價格昂貴，一般實驗室難以接受。液相色譜-熒光檢測器法，因為其儀器價格相對便宜、適用性強，樣品預(yù)處理簡單，是目前AFTB1檢測最常見的方法。植物油成分以脂肪酸為主，并富含蛋白質(zhì)、維生素等物質(zhì)[18]，成分復(fù)雜且易溶AFTB1[19]，與谷物類樣品相比，植物油前處理的關(guān)鍵是去除油脂，油脂殘留較多不僅會影響測定結(jié)果，還會污染檢測設(shè)備[20]。目前采用的主要凈化方法是國際通用的免疫親和柱凈化法[21]，但該方法所使用的前處理凈化耗材較為昂貴，這給不少科研工作和相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)增加不小負(fù)擔(dān)。

本研究利用植物油在低溫狀態(tài)會凝結(jié)這一物理特性，采用低溫冰箱冷凍處理提取試樣，使植物油冷凝固化，同時利用密度差異，采用冷凍離心沉淀提取液中殘留的植物油懸浮物、凈化提取液，建立了一種低成本、高準(zhǔn)確度測定植物油中AFTB1含量的前處理凈化方法，即冷凍-離心凈化法。與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016中高效液相色譜-柱前衍生法進(jìn)行對比，該方法降低了檢測成本，也提升了結(jié)果穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度確定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽油、菜籽油、花生油、玉米油、大豆油，各6批次，均為市售。AFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 μg/mL；乙腈、正己烷：色譜純；三氟乙酸：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity II液相色譜儀-熒光檢測器；Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；IKA SM3旋渦振蕩器；盧湘儀TGL-20M冷凍離心機；Anpel DC-12氮吹儀。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

流動相：A相為水，B相為乙腈；梯度洗脫：15% B(0 mim)，30% B(0～6.0 min)，35% B(6.0～9.0 min)，15% B(9.0 ～14.0 min)；流速：0.8 mL/min；柱溫:35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL； 檢測波長：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

1.3.2 提取液選擇實驗

稱取各試樣1 g于10 mL離心管中，各加入5 mL正己烷、石油醚、乙腈+水提取液(100+0，95+5，90+10，85+15，80+20)，高速渦旋提取1 min后置于低溫冰箱中冷凍處理，設(shè)置冰箱溫度-12 ℃，2 h后觀察凝結(jié)狀態(tài)，以單次提取回收率確定提取液的優(yōu)選方案。

1.3.3 低溫冰箱冷凍溫度選擇實驗

稱取各試樣1 g于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈-水萃取液(90+10)，高速渦旋提取1 min后置于低溫冰箱中冷凍處理，設(shè)置冰箱溫度-4、-8、-12、-16、-20 ℃，2 h后觀察萃取液中植物油凝結(jié)狀態(tài)，擇其冷凍結(jié)塊良好的批次進(jìn)行冷凍離心凈化處理。

1.3.4 冷凍離心轉(zhuǎn)速選擇實驗

稱取油茶籽油1 g于10 mL離心管中，加入AFTB1使其含量為0.40 μg/kg，再加入5 mL乙腈-水萃取液(90+10)，高速渦旋提取1 min后置于-12 ℃的低溫冰箱中冷凍處理2 h。設(shè)置離心機溫度為-12 ℃，分別調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 r/min對提取液進(jìn)行5 min離心，吸取上清液1 mL于衍生瓶中，氮吹至近干后進(jìn)行衍生及上機測定，以回收良好的轉(zhuǎn)速為優(yōu)選轉(zhuǎn)速。重復(fù)6次。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將AFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈-水(90+10)配置成10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，準(zhǔn)確移取0、10、20、50、100、200、500 μL標(biāo)準(zhǔn)使用液于衍生瓶中，50 ℃下用N2緩緩地吹至近干,分別加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，渦旋30 s，在40 ℃的水浴鍋衍生15 min，衍生結(jié)束后，在50 ℃下用N2緩緩地將衍生液吹至近干，取下待冷卻至室溫后用初始流動相定容至1.0 mL，渦旋 30 s溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中待液相色譜檢測。重復(fù)6次。樣品中AFTB1含量計算方法如公式(1)所示：

X=(Ca-Cb)×V3×V1×f/ (V2×m)

(1)

式中：X為樣品中AFTB1含量/μg/kg；Ca為樣品檢測液中AFTB1的濃度/μg/L；Cb為空白檢測液中AFTB1的濃度/μg/L；V3為待測液定容體積/1 mL；V1為提取液體積/5 mL；V2為提取液分取待凈化液體積/1 mL；f為稀釋倍數(shù)；m為樣品稱樣質(zhì)量/g。

1.3.6 冷凍-離心凈化法和GB 5009.22—2016方法的回收率和精密度對比實驗

分別稱取5種植物油各4份，每份1 g于10 mL離心管中，每種樣品中AFTB1的添加濃度分別為0、0.5、1、5 μg/kg，加入5 mL乙腈-水萃取液(90+10)，高速渦旋混勻3 min后置于-12 ℃低溫冰箱中冷凍處理2 h，取出后置于-12 ℃冷凍離心機中10 000 r/min離心凈化5 min，待完成離心后迅速吸取上清液1 mL于衍生瓶中，并于50 ℃下用氮氣緩緩地吹至近干，再加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸于衍生瓶中，渦旋30 s后在40 ℃的水浴鍋中衍生15 min，待衍生完成后繼續(xù)在50 ℃下用氮氣緩緩地將衍生液吹至近干，取出衍生瓶待冷卻至室溫后用初始流動相定容至1.0 mL，渦旋30 s溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中，上液相色譜檢測。重復(fù)6 次。同時參照GB 5009.22—2016中第二法測定油茶籽油、菜籽油、花生油、玉米油、大豆油等5植物油中AFTB1的加標(biāo)回收率和精密度，對比兩種檢測方法的回收率和精密度。

1.3.7 冷凍-離心凈化法對市場植物油產(chǎn)品中AFTB1的含量分析實驗

分別稱取油茶籽油、菜籽油、花生油、玉米油、大豆油等5種30批次源于杭州市場的植物油樣品各2份，每份1 g于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈-水(90+10)提取液，后續(xù)處理按照1.3.6進(jìn)行，并上機測定，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液選擇

各提取液均能完全溶解植物油，但在冷凍之后，以正己烷、石油醚為提取溶劑的提取體系并未出現(xiàn)冷凝現(xiàn)象，仍為均勻一致的溶液，未達(dá)到冷凍凈化的目的，故將其排除。乙腈+水的提取液組合提取冷凍后均能出現(xiàn)冷凝固化現(xiàn)象，均可達(dá)到凈化目的，其中純乙腈溶解植物油后需經(jīng)過5 h以上才能發(fā)生凝固現(xiàn)象。提升取液中水的占比有利于冷凝，當(dāng)水占比為10%～15%冷凝效果最佳，但達(dá)20%時離心后提取液體系會分為3層，部分游離水單獨析出，沉于底層，植物油介于乙腈層和水層之間。通過對單次提取試驗的回收率測定，水占比為10%、15%的提取液均能達(dá)到80%以上，故在后續(xù)實驗中均采用乙腈-水比例為90∶10的提取液。

在乙腈+水提取液配比選擇實驗中，水占比量可直接影響測定結(jié)果，對此筆者認(rèn)為水在提取體系中有多重作用。一是有助于植物油中AFTB1滲透溶出。植物油成分以脂肪酸為主，并富含蛋白質(zhì)、維生素等物質(zhì)[18]，成分復(fù)雜，其中部分可滲水令其膨脹，增加目標(biāo)物的比表面積，有助于AFTB1的分離和提取，如同田芳潔等[22]在測定人參提取物中的苯并(a)芘時加水的作用，以及農(nóng)殘檢測中對干樣品需加水浸漬后再行前處理[23,24]。二是可提升植物油的冷凝溫度。本研究中油茶籽油、菜籽油、玉米油、大豆油4種植物油的冰點均比水低，滲入水分或可提升其冰點，助其在提取液中凝結(jié)成塊。三是改變提取液體系密度。離心過程中，兩相間密度差是影響離心結(jié)果的關(guān)鍵[25]，在本研究中由于水的加入，既改變了提取液本身的密度，又影響著油凝結(jié)后的密度，當(dāng)體系中水含量較高時，可能造成了提取液和冷凝后的植物油密度差變小，以致影響到植物油沉降，離心結(jié)果不良，這與吳山等[26]的液膜法提取L—苯丙氨酸有相似之處。

2.2 低溫冰箱冷凍溫度的選擇

通過設(shè)置不同的冷凍溫度，5種植物油樣品批表現(xiàn)為完全凝固過程如圖1所示，隨著冷凍溫度降低，除花生油外，其他植物油樣品批均呈部分凝固到全部凝固趨勢。-4 ℃時花生油樣品批已全部凝固，其他油種均有部分批次未凝固，其中油茶籽油樣品批均未凝固。-8 ℃時僅油茶籽油有一批次未凝固，其余樣品批全部凝固。-12 ℃至更低溫度時所有樣品批均凝固，故本研究后續(xù)試驗冷凍溫度均為-12 ℃。在低溫狀態(tài)下，發(fā)朦、呈現(xiàn)絮狀物甚至發(fā)生凝固是植物油脂固有屬性，但每種植物油脂發(fā)生這類現(xiàn)象的溫度又有所不同，通常飽和脂肪酸含量比越高，發(fā)生凝固現(xiàn)象的溫度點也越高。同種植物油在冷凍處理時的冷凝固化的溫度有差異，筆者認(rèn)為主要是由于油品煉制方法和程度所致。本次購買的植物油有毛油、精煉油，有壓榨油、浸提油，同種油間會因其所含蠟質(zhì)、固體脂、蛋白質(zhì)等種類與含量不同而影響其凝固溫度，左青等[27]在冬化處理植物油中也有類似發(fā)現(xiàn)。

2.3 冷凍離心轉(zhuǎn)速選擇

將冷凍處理的樣品在-12 ℃下按4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行5 min離心凈化，隨著離心速率的增大所有樣品批凈化結(jié)果均有明顯改善。轉(zhuǎn)速為4 000、6 000 r/min的樣品上清液中均有不同程度的油點、顆粒物；當(dāng)轉(zhuǎn)速為8 000 r/min時，所有上清液已示清澈。提升轉(zhuǎn)速至12 000 r/min時，上清液仍均清澈透明。對不同轉(zhuǎn)速的處理樣品進(jìn)行上機測定并計算回收率，結(jié)果如表1所示，離心速度對測定結(jié)果有顯著影響(P<0.05)。隨著離心速率的提升，AFTB1的回收率逐漸增大，且6次重復(fù)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差逐漸降低。當(dāng)轉(zhuǎn)速提升至8 000 r/min時，回收率最高僅為77.5%，當(dāng)升至12 000 r/min時，回收率可達(dá)90.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也降低了1.7%。離心主要是去除提取液中殘存的油脂、腺體、蛋白質(zhì)等懸浮物，以免其在后續(xù)衍生過程中產(chǎn)生負(fù)作用，實驗結(jié)果也表明這些殘留物確實會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。8 000 r/min離心后，提取液雖已清澈，但可能仍然含有一定量的油脂，影響到衍生程度，以致回收率不高；當(dāng)升至12 000 r/min離心后，上清液中的這些影響衍生的物質(zhì)進(jìn)一步減少，凈化程度得以加深，檢測結(jié)果回收率得以明顯提升。故后續(xù)樣品處理時冷凍離心轉(zhuǎn)速均為12 000 r/min，按照冷凍離心機明示功率計算得此時的離心力約為1.4萬×g。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線以及方法的檢測限

按1.3.6節(jié)步驟處理，得標(biāo)樣色譜及方法的校準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2.321 987x+0.001 377，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 7，在0.10～5.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，按6倍噪聲值作為儀器檢出限，可得儀器檢出限為0.004 μg/L，并帶入式(1)可得方法檢出限為0.02 μg/kg。如圖2所示，從上到下分別是免疫親和柱凈化、標(biāo)液、冷凍-離心凈化的AFTB1濃度為1.0 μg/L的測定液色譜圖。

圖2 AFTB1測定液(1.0 μg/L)色譜圖

2.5 回收率和精密度對比實驗

如表2所示，在冷凍-離心凈化法試樣中分別添加低中高濃度AFTB1時，回收率分別為80.2%～90.4%、82.4%～92.8%、82.4%～92.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.4%～3.7%、2.9%～4.4%、2.9%～4.7%。不同添加水平的平均回收率為80.2%～93.2%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～4.7%。而GB 5009.22—2016中的免疫親和柱(MycoSep 226 AflaZon+)凈化法在3 個不同添加水平下的回收率為66.7%～84.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～6.2%。在做免疫親和柱凈化時發(fā)現(xiàn)，含AFTB1相同濃度的樣品提取液和純標(biāo)液過柱后，樣品提取液的測定值均低于純標(biāo)液的測定值，表明免疫親和柱對AFTB1可能有吸附，或者對樣品凈化能力有限影響到后續(xù)的衍生反應(yīng)，致使回收率偏低。通過降低過柱速度可以略微提升回收效果，但穩(wěn)定性仍相對較差。而冷凍-離心凈化法回避了過柱，不存在這一現(xiàn)象，雖延長了前處理時間，但提升了回收率和精密度。

表2 不同樣品中AFTB1的回收率和精密度(n=6)

2.6 市場植物油產(chǎn)品中AFTB1的含量分析

對市售油茶籽油、菜籽油、花生油、玉米油、大豆油等5種30批次源植物油樣品進(jìn)行了測定，AFTB1的濃度范圍為

3 結(jié)論

通過實驗驗證，植物油中AFTB1可以采用冷凍-離心凈化-高效液相色譜法進(jìn)行檢測分析，優(yōu)化的乙腈-水提取液配比為90∶10，低溫冰箱冷凍溫度為-12 ℃，冷凍離心轉(zhuǎn)速為12 000 r/min、離心力約為1.4萬×g，以水浴加熱的方式進(jìn)行衍生。該方法的定量檢出限為0.02 μg/kg，校準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2.321 987x+0.001 377，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 7，在0.10～5.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。當(dāng)AFTB1添加量分別為0.5、1.0、5.0 μg/kg時，平均回收率為80.2%～93.2%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～4.7%(n=6)。本方法的檢出限符合國內(nèi)外對植物油中AFTB1多環(huán)芳烴的限量且重復(fù)性好，可滿足大量樣品快速、準(zhǔn)確定量分析的需要。