王嵌 張巍 王雯 薛晶 桑偉 胡衍冉 翟陽陽 馬志萍

圖1 MSI-H結(jié)直腸癌的免疫組織化學(xué)染色

在中國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升［1］。結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制主要有3種：1）最常見的是染色體不穩(wěn)定性，占結(jié)直腸癌的75%。2）DNA甲基化的表觀遺傳修飾，也稱CpG島甲基化表型，占結(jié)直腸癌的20%。3）微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microstatellites instability，MSI）或DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷（mismatch repair deficiency，dMMR），存在于約15%的結(jié)直腸癌中［2］，CpG島甲基化表型和dMMR/MSI表型之間常有重疊。dMMR/MSI表型可在散發(fā)的結(jié)直腸癌（75%）或Lynch綜合征（25%）中發(fā)生［3］。Lynch綜合征患者患各種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)均有所增加，對(duì)該類患者家屬進(jìn)行早期癌癥篩查有助于早期診斷和及時(shí)干預(yù)［4］。此外，dMMR/MSI表型較MMR蛋白表達(dá)完整（MMR proficient，pMMR）/微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）表型有更好的預(yù)后［5］，且輔助氟尿嘧啶化療不能使Ⅱ期dMMR/MSI結(jié)直腸癌患者獲益［6］，故不推薦Ⅱ期dMMR/MSI結(jié)直腸癌輔助化療。因此，識(shí)別dMMR/MSI結(jié)直腸癌具有重要的臨床意義。目前，篩查結(jié)直腸癌MMR基因缺失最常用的方法為通過免疫組織化學(xué)染色分析MMR蛋白的表達(dá)，或通過PCR擴(kuò)增特異性微衛(wèi)星重復(fù)序列來檢測(cè)。本研究旨在通過對(duì)兩種檢測(cè)方法的分析，尋找更經(jīng)濟(jì)有效的檢測(cè)策略。

1 材料與方法

1.1 一般資料

分析新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018年9月至2019年9月收治并行手術(shù)的結(jié)直腸癌患者腫瘤組織共223例，其中男性122例，女性101例，年齡25～91歲，平均年齡（63.5±13.0）歲，漢族176例，非漢族47例。復(fù)閱H&E切片并統(tǒng)計(jì)腫瘤的發(fā)生部位、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、有無神經(jīng)侵犯、有無脈管癌栓、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有無黏液/印戒分化等臨床病理特征。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判讀 結(jié)直腸癌MMR蛋白檢測(cè)一抗：鼠抗人MLH1單克隆抗體（M1），鼠抗人MSH2單克隆抗體（G219-1129），兔抗人MSH6單克隆抗體（SP93），鼠抗人PMS2單克隆抗體（A16-4），均購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。使用羅氏Ventana BenchMark ULTRA全自動(dòng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)平臺(tái)（德國）進(jìn)行檢測(cè)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判讀：MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白均定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色染色為表達(dá)（+），不著色為缺失（-）。4種蛋白均表達(dá)為（+）判為pMMR，而其中任意一種表達(dá)為（-）則判為dMMR。

1.2.2 MSI分子檢測(cè)及結(jié)果判讀 使用PCR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)MSI，選取對(duì)應(yīng)的癌旁組織作為對(duì)照，樣本經(jīng)DNA提取、PCR擴(kuò)增、毛細(xì)管電泳分離。使用Microread MSI檢測(cè)試劑盒（北京閱微公司），一次擴(kuò)增檢測(cè)6個(gè)MSI位點(diǎn)（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27）。根據(jù)說明書，有兩個(gè)或兩個(gè)以上不穩(wěn)定位點(diǎn)被認(rèn)為是微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-high，MSI-H），無任何不穩(wěn)定性被認(rèn)為是MSS，僅1個(gè)不穩(wěn)定位點(diǎn)被認(rèn)為是微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（MSI-low，MSI-L）。樣品檢測(cè)時(shí)，使用分子量內(nèi)標(biāo)來計(jì)算等位基因片段大小，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用PRISM3130xl遺傳分析儀（美國ABI公司）檢測(cè)，輸出數(shù)據(jù)通過GeneMapper V4.0軟件進(jìn)行分析，確定腫瘤MSI狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR蛋白表達(dá)情況

223例結(jié)直腸癌中，有27例（12.1%）dMMR，MSI-H 25例，MSS 2例；196例（87.9%）pMMR，MSI-H 2例，MSS 194例。PMS2陰性21例（9.4%），MSI-H 19例，MSS 2例。MLH1陰性20例，MSI-H 18例，MSS 2例。MSH2陰性4例（1.8%），均為MSI-H。MSH6陰性6例（2.7%），均為MSI-H。dMMR以MLH1與PMS2表達(dá)聯(lián)合缺失20例，其次為MSH2與MSH6表達(dá)聯(lián)合缺失4例，MSH6蛋白單獨(dú)缺失2例，PMS2單獨(dú)缺失1例（圖1）。

2.2 MSI結(jié)果分析

PCR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)中有27 例（12.1%）為MSI-H（圖2），196 例（87.9%）為MSS，本研究中無MSI-L 病例。其中NR-21 位點(diǎn)不穩(wěn)定26 例，NR-24位點(diǎn)不穩(wěn)定19 例，NR-27 位點(diǎn)不穩(wěn)定25 例，BAT-25位點(diǎn)不穩(wěn)定24例，BAT-26位點(diǎn)不穩(wěn)定25例，MONO-27 位點(diǎn)不穩(wěn)定21 例。在6 個(gè)位點(diǎn)中，NR-21、NR-27和BAT-26 的靈敏度較高，分別為96.3%、92.6%、92.6%，NR-24、BAT-25 和MONO-27 的靈敏度較低，分別為70.4%、88.9%和77.8%。

2.3 MSI狀態(tài)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析

MSI-H結(jié)直腸癌的臨床及病理特征與MSS不同，在民族、腫瘤位置、腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MSI-H非漢族發(fā)病率（25.5%）較漢族發(fā)病率（8.5%）高（P=0.001），與MSS結(jié)直腸癌相比，MSI-H結(jié)直腸癌多位于右半結(jié)腸（81.5%，P＜0.001），分化程度低（55.6%，P=0.006），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少（25.9%，P=0.044）。在神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、臨床分期、是否有黏液/印戒分化方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.4 PCR-毛細(xì)管電泳法與免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比分析

223 例病例中219 例（98.2%）免疫組織化學(xué)法與PCR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)結(jié)果一致，為dMMR/MSI 或pMMR/MSS；4 例（1.8%）檢測(cè)結(jié)果不一致，為pMMR/MSI或dMMR/MSS。兩種方法具有很強(qiáng)的一致性（κ=0.916）。以MSI檢測(cè)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，MMR檢測(cè)的靈敏度為92.6%，特異度為99.0%，包含PMS2 和MSH6 的2種抗體試驗(yàn)篩查dMMR 結(jié)直腸癌的靈敏度和特異度與4 種抗體試驗(yàn)（MLH1、MSH2、PMS2、MSH6）的靈敏度和特異度均相同（表2）。以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”時(shí)發(fā)現(xiàn)，將MSI 定義為3 種標(biāo)記（NR-21、NR-27、BAT-26）至少有1處不穩(wěn)定時(shí)，得出的結(jié)果與6種標(biāo)記組（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27）完全相同（表3）。

圖2 PCR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)結(jié)果

表1 微衛(wèi)星狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性

表1 微衛(wèi)星狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性（續(xù)表1）

表2 兩種免疫組織化學(xué)法預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌MSI的比較 例（%）

表3 兩種MSI檢測(cè)方案檢測(cè)MMR蛋白表達(dá)的比較 例（%）

3 討論

結(jié)直腸癌的分子表型與臨床病理特征、生物學(xué)行為、患者預(yù)后甚至治療反應(yīng)密切相關(guān)。通過MMR蛋白檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行初篩后，部分患者需要進(jìn)行MSI 基因檢測(cè)，以準(zhǔn)確判斷患者是否具有MSI 特征。dMMR/MSI篩查不僅對(duì)Lynch綜合征篩查至關(guān)重要，而且對(duì)治療管理也同樣重要。在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中，dMMR/MSI僅占約3%～5%，并且與預(yù)后不良和對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療的化療抗性有關(guān)［7-8］。近期的非隨機(jī)試驗(yàn)表明，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在耐化療的dMMR/MSI轉(zhuǎn)移性腫瘤中具有較高的療效［9-10］。

部分國外研究中，dMMR的檢出率分別為13.3%、16.4%、10.24%、12.2%［11-14］，與本研究結(jié)果相近。胡曉儒等［15］的研究中，dMMR的檢出率為6.7%，低于本研究，可能與樣本量不同產(chǎn)生的偏倚有關(guān)。另有國外研究中，PCR-毛細(xì)管電泳法對(duì)MSI的檢出率分別為12%、11%、15.1%、11.5%［12-14，16-17］，與本研究結(jié)果相近。本研究223例病例中免疫組織化學(xué)與MSI分子檢測(cè)結(jié)果的不一致率為1.8%，與既往文獻(xiàn)相符［18］。

MMR基因蛋白在細(xì)胞中通常以異質(zhì)二聚體復(fù)合物形式存在，其中，MLH1和MSH2是必需的二聚體，分別與PMS2和MSH6結(jié)合。如果MLH1和MSH2因各自的MMR基因突變而降解，那么它們相應(yīng)的伴侶蛋白也將隨之降解，而PMS2或MSH6的突變可能不會(huì)導(dǎo)致MLH1和MSH2的蛋白水解降解，因?yàn)橐詥误w形式存在的MLH1和MSH2蛋白質(zhì)可以與MMR系統(tǒng)的其他蛋白質(zhì)相互作用，即MSH3，從而避免降解。此外，PMS2或MSH6的單獨(dú)缺失并不罕見，有研究分析了兩種蛋白（MLH1 和MSH2）的MMR表達(dá)，但未能檢測(cè)到PMS2或MSH6的單獨(dú)表達(dá)缺失［18］。因此，建議使用PMS2和MSH6兩種抗體組合篩查dMMR結(jié)直腸癌。本研究中，包含PMS2和MSH6的2種抗體試驗(yàn)篩查dMMR結(jié)直腸癌的靈敏度和特異度與4種抗體試驗(yàn)（MLH1、MSH2、PMS2、MSH6）的靈敏度和特異度均相同。因此，含有PMS2和MSH6的2種抗體試驗(yàn)是dMMR結(jié)直腸癌最簡單的初篩方法，其和傳統(tǒng)的4種抗體試驗(yàn)一樣有效，但費(fèi)用減半，可推薦使用。MSI試驗(yàn)作為dMMR篩選的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在臨床和病理試驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。但是，復(fù)雜的程序和昂貴的成本使小型試驗(yàn)室難以普遍實(shí)施，特別是在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)。然而，MSI檢測(cè)在某些情況下是無法替代的，如免疫組織化學(xué)表達(dá)完整的MSI腫瘤（非功能蛋白表達(dá)），或傳統(tǒng)四基因以外的其他錯(cuò)配修復(fù)基因異常。免疫組織化學(xué)染色的不確定性和結(jié)果解釋的主觀性也將影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，MSI檢測(cè)是不可或缺的。有研究表明，僅含BAT-26和NR-24的檢測(cè)可能對(duì)篩查MMR缺陷的結(jié)直腸癌有效［19］。本研究中，與其余5個(gè)標(biāo)記相比，NR-24的靈敏度最低。此外，BAT-26是一種準(zhǔn)單態(tài)標(biāo)記，位于MSH2外顯子5的3'處，被認(rèn)為是MSI檢測(cè)的非常敏感和特異的標(biāo)記。然而，包含BAT-26位點(diǎn)的MSH2缺失的結(jié)直腸癌并不少見，在這種情況下，盡管腫瘤是MMR缺陷，但BAT26位點(diǎn)將導(dǎo)致來自腫瘤組織中正常細(xì)胞的野生型等位基因的假陰性擴(kuò)增［20］。提示盡管BAT-26經(jīng)常用于MSI的測(cè)定，但單獨(dú)使用BAT-26或與NR-24等不太準(zhǔn)確的標(biāo)記物結(jié)合使用，均可能低估MSI。為尋找更經(jīng)濟(jì)簡便且準(zhǔn)確的方式，本研究分析了6個(gè)位點(diǎn)的失穩(wěn)情況，其中NR-21、NR-27和BAT-26的靈敏度較高，NR-24、BAT-25和MONO-27的靈敏度較低，與既往研究相符［21］。因此，建議可檢測(cè)3種標(biāo)記（NR-21、NR-27和BAT-26）替代6種標(biāo)記，對(duì)MSI的檢測(cè)具有經(jīng)濟(jì)意義。

綜上所述，本研究推薦使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMR 時(shí)，可采用PMS2 和MSH6 兩種抗體組篩查dMMR 結(jié)直腸癌；使用PCR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)MSI時(shí)，可采用3種標(biāo)記組（NR-21、NR-27和BAT-26）檢測(cè)。這兩種簡化的檢測(cè)方案為結(jié)直腸癌dMMR/MSI的鑒定提供了簡便、可靠、價(jià)格低廉的方法，對(duì)推廣結(jié)直腸癌DNA MMR基因缺失的篩查具有經(jīng)濟(jì)意義。