賈金芳 黃靜 朱曉莉

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。肺癌的平均5年生存率為17.4%，而IA期肺癌10年生存率達(dá)92%［2-3］，由此可見，早診早治是提高肺癌總體生存率的關(guān)鍵。早期肺癌多表現(xiàn)為肺結(jié)節(jié)，肺結(jié)節(jié)通常指影像學(xué)表現(xiàn)為直徑≤3 cm的局灶性、類圓形、密度增高的實(shí)性或亞實(shí)性肺部陰影，可分為孤立性和多發(fā)性病變，不伴肺不張、肺門淋巴結(jié)腫大和胸腔積液［4］。近年來，隨著低劑量螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描（low dose spiral computed tomography，LDCT）在肺癌篩查中的廣泛應(yīng)用，外周肺結(jié)節(jié)的檢出率顯著提高，已達(dá)到93.8%，令肺癌死亡率降低20%。然而，LDCT存在假陽性率高（96.4%）和潛在的放射性損傷等問題［5-6］。

近年來腫瘤相關(guān)自身抗體（autoantibodies，AABs）在肺癌的相關(guān)研究中顯示出較好的診斷價(jià)值，已被部分歐美國家批準(zhǔn)用于肺癌的早期診斷［7］。Zhang等［3］研究發(fā)現(xiàn)，p53、SOX2、GAGE7和MAGE-A1在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表達(dá)明顯升高，PGP9.5 在肺鱗癌中表達(dá)較高，GBU4-5在肺腺癌中表達(dá)較高。Ren等［8］在中國高危人群中采用7-AABs（p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE-A1和CAGE）和LDCT對早期肺癌進(jìn)行篩查，結(jié)果顯示肺癌診斷的敏感性和特異性分別為61%和90%，7-AABs 和LDCT 結(jié)合顯著提高磨玻璃結(jié)節(jié)（ground glass nodule，GGN）和（或）實(shí)性結(jié)節(jié)（solid nodule，SN）診斷的準(zhǔn)確率，具有一定的臨床應(yīng)用前景。但目前關(guān)于腫瘤自身抗體在0～ⅠA期肺癌患者中的診斷價(jià)值少有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究通過檢測肺結(jié)節(jié)患者血漿中AABs水平，探討自身抗體在惡性肺結(jié)節(jié)中的診斷價(jià)值。比較并分析7-AABs 與腫瘤標(biāo)志物、Mayo 模型聯(lián)合檢測的診斷效能，并分析7-AABs陽性表達(dá)與CT征象的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年12月至2019年2月東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院胸心外科和呼吸科收治的患者，所有患者均通過LDCT評估發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)，并經(jīng)手術(shù)取得病理診斷結(jié)果。收集術(shù)前臨床資料，包括CT征象、血液學(xué)檢查結(jié)果［（癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、細(xì)胞角蛋白19片段21-1（cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA 21-1）和AABs］、性別、年齡和吸煙史等，其中“無吸煙者”是指既往吸煙量少于100支的人。入選標(biāo)準(zhǔn)：1）胸部CT發(fā)現(xiàn)直徑≤30 mm的肺結(jié)節(jié)，包括純磨玻璃結(jié)節(jié)（pure GGN，pGGN）、混合磨玻璃結(jié)節(jié)（mixed GGN，mGGN）和SN；2）無肺癌病史；3）5年內(nèi)無確診或治療的其他腫瘤病史；4）肺部未經(jīng)任何放療、免疫治療或手術(shù)治療；5）無自身免疫性疾病史；6）無嚴(yán)重肝腎功能不全病史。本研究經(jīng)東南大學(xué)中大醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 LDCT掃描參數(shù)及閱片 采用GE HD750 64排128層螺旋CT掃描機(jī)，螺距設(shè)定≤1，機(jī)架旋轉(zhuǎn)時(shí)間≤1.0 s，掃描矩陣設(shè)定不低于512×512；掃描參數(shù)為120kVp、30～50 mAs。根據(jù)Fleischner學(xué)會(huì)于2017年發(fā)布的肺結(jié)節(jié)大小測量建議，對SN和GGN在軸位、冠狀位及矢狀位選擇結(jié)節(jié)最大層面，根據(jù)結(jié)節(jié)大小取長軸和短軸平均值（＜10 mm）或分別記錄長軸和短軸（≥10 mm）。所有的患者胸部CT均采用連續(xù)薄層掃描（≤1.5 mm，常用1.0 mm或1.25 mm），常規(guī)重建連續(xù)冠狀位和（或）矢狀位，層厚1.0 mm。CT診斷由兩位有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)生閱片，當(dāng)意見不一致時(shí)經(jīng)協(xié)商取得一致。

1.2.2 腫瘤相關(guān)自身抗體檢測方法 采取患者術(shù)前空腹外周靜脈血5 mL，2 000 r/min 離心15 min，分離血清，室溫（18～25℃）保存，并于8小時(shí)內(nèi)通過ELISA法檢測血清樣品中的7 種自身抗體的濃度。試劑盒由杭州凱保羅生物科技有限公司提供，并由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照說明操作。用酶標(biāo)儀在反應(yīng)結(jié)束后30 min內(nèi)讀取波長450 nm處的光密度值（OD450），并計(jì)算自身抗體的相對濃度。試劑盒中自身抗體參考范圍（U/mL）：p53＜13.1，PGP9.5＜11.1，SOX2＜10.3，GAGE7＜14.4，GBU4-5＜7.0，MAGEA1＜11.9，CAGE＜7.2。7 種自身抗體中的1 種或多種自身抗體的檢測結(jié)果高于其陽性判斷值時(shí)則診斷為“陽性”；所有自身抗體檢測結(jié)果均低于陽性判斷值水平則定義為“陰性”。

1.2.3 傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物檢測方法 由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室采用化學(xué)發(fā)光法檢測CEA、NSE 和CYFRA21-1。試劑盒中腫瘤標(biāo)志物參考范圍（ng/mL）：CEA＜5.0，NSE＜16.3，CYFRA21-1＜3.3。

1.2.4 MAYO 模型 惡性腫瘤概率=ex/（1+ex），x=-6.827 2+（0.039 1×年齡）+（0.791 7×吸煙）+（1.338 8×惡性腫瘤）+（0.127 4×直徑）+（1.040 7×毛刺）+（0.783 8×位置）

公式說明：①e：自然系數(shù)；②年齡：患者年齡（年）；③吸煙：曾經(jīng)/正在吸煙計(jì)為1，否則計(jì)為0；④惡性腫瘤：如患者有胸腔外惡性腫瘤史＞5年計(jì)為1，否則計(jì)為0；⑤直徑：結(jié)節(jié)的最大直徑（mm）；⑥毛刺：如結(jié)節(jié)邊緣有毛刺計(jì)為1，否則計(jì)為0；⑦位置：如結(jié)節(jié)位于肺上葉計(jì)為1，否則計(jì)為0。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽性樣本的數(shù)量和比例以二項(xiàng)式比例的95%置信區(qū)間（95% confidence interval，95%CI）表示。采用二元Logistic 回歸分析預(yù)測肺癌與研究指標(biāo)間的關(guān)系。采用受試者工作特征（ROC）曲線，計(jì)算AUC值評估自身抗體、Mayo模型診斷惡性肺結(jié)節(jié)的效能。

2 結(jié)果

2.1 入組患者臨床特征

共納入208例肺結(jié)節(jié)患者，包括150例（72.1%）肺癌患者和58 例（27.9%）良性肺疾病患者。肺癌均為NSCLC，包括141例（94.0%）腺癌、7例（4.7%）鱗癌和2例（1.3%）大細(xì)胞癌，患者多數(shù)為女性（62.0%）和非吸煙者（64.7%）。肺癌組和良性肺疾病組的年齡差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007），在性別、吸煙史、結(jié)節(jié)大小和結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)方面，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

表1 患者的一般資料

2.2. 7-AABs在肺結(jié)節(jié)患者中的診斷價(jià)值

2.2.1 7-AABs 診斷惡性肺結(jié)節(jié)的敏感性、特異性和PPV 在所有患者中，單個(gè)自身抗體檢測的特異性較高（94.8%～100%），敏感性較低（8.7%～15.3%）。7種自身抗體聯(lián)合檢測敏感性提高至54.7%，優(yōu)于單個(gè)自身抗體檢測（均P＜0.001）；7-AABs 的特異性和陽性預(yù)測值（positive predictive valve，PPV）分 別 為87.9%和92.1%，與單個(gè)自身抗體檢測相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表2）。結(jié)合AUC 值，提示7種自身抗體聯(lián)合檢測的效能優(yōu)于單一自身抗體檢測。值得注意的是，7-AABs 中2 個(gè)及以上自身抗體同為陽性時(shí)，其在肺癌診斷中的PPV（96.6%）高于單個(gè)自身抗體陽性時(shí)的PPV（90.0%，表2）。

2.2.2 7-AABs 在不同肺癌分期、結(jié)節(jié)大小和密度中的敏感性比較 為進(jìn)一步研究7-AABs 在早期肺癌中的診斷價(jià)值，對肺癌組進(jìn)行亞組分析。7-AABs 在0～ⅠA 期肺癌中的總體敏感性為54.5%（95% CI：46.3%～62.8%）。不同肺癌分期的敏感性見表3。

為評估7-AABs在不同結(jié)節(jié)大小中的診斷價(jià)值，對不同結(jié)節(jié)大小亞組（≤8 mm、9～20 mm和＞20 mm）間的陽性結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，7-AABs在亞組間的敏感性和PPV差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表3）。同時(shí)，為評估7-AABs在不同肺結(jié)節(jié)密度中的診斷價(jià)值，對不同密度亞組（pGGN、mGGN和SN）間的陽性結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，7-AABs在不同密度亞組間的敏感性和PPV差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表3）。

2.3 7-AABs與腫瘤標(biāo)志物診斷價(jià)值的比較

7-AABs 與CEA、NSE、CYFRA21-1 及其組合比較，均顯示出更高的敏感性（均P＜0.05），特異性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表4）。7-AABs 與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測顯著提高肺癌的診斷能力，敏感性達(dá)70.0%（P＜0.05）。

2.4 7-AABs與Mayo模型聯(lián)合診斷肺癌的價(jià)值

為進(jìn)一步提高診斷能力，將7AABs 與Mayo 模型聯(lián)合用于肺癌診斷。使用單陽規(guī)則將7-AABs 添加到Mayo模型中，即個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)大于風(fēng)險(xiǎn)閾值或7-AABs中任一抗體陽性則判定為陽性。對于固定的風(fēng)險(xiǎn)閾值，例如設(shè)置Mayo模型的風(fēng)險(xiǎn)閾值為30%，當(dāng)使用單陽性規(guī)則將7-AABs 添加到Mayo 模型中，相對于7-AABs、Mayo 模型，敏感性提高至68.7%（P1＜0.001），PPV提高至89.6%，AUC提高至0.699（表5）。

若使用雙陽規(guī)則將7-AABs 添加到Mayo 模型中，即個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)大于風(fēng)險(xiǎn)閾值且7-AABs中任一抗體陽性則判定為陽性。對于固定的風(fēng)險(xiǎn)閾值（如30%），Mayo 模型和7-AABs 聯(lián)合檢測時(shí)，相對于7-AABs和Mayo模型，特異性提高至96.6%，PPV提高至94.1%，敏感性有所下降，為21.3%（表5）。

2.5 7-AABs與CT征象的相關(guān)性

在所有患者中，7-AABs陽性表達(dá)與短毛刺、空泡征具有相關(guān)性，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032、P=0.017），與腫瘤外形、腫瘤邊界、分葉、支氣管充氣征、血管集束征、胸膜凹陷征、CT值均無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表6）。

表2 7-AABs與單個(gè)自身抗體的Sens、Spec和PPV比較

表3 7-AABs在不同肺癌分期、結(jié)節(jié)大小和密度中的敏感性和PPV比較

表4 7-AABs與腫瘤標(biāo)志物的敏感性、特異性和PPV比較

表4 7-AABs與腫瘤標(biāo)志物的敏感性、特異性和PPV比較（續(xù)表4）

表5 Mayo模型聯(lián)合7-AABs與Mayo模型、7-AABs的比較

表6 7-AABs陽性表達(dá)與CT征象的相關(guān)性

3 討論

在肺癌發(fā)展過程中，人體通過體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生針對腫瘤相關(guān)抗原的特異性自身抗體，血清AABs被認(rèn)為是潛在的肺癌生物標(biāo)志物［9］。Li 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在吸煙的慢性阻塞性肺疾病或石棉沉積癥患者被診斷為肺癌前已經(jīng)可以檢測到p53。尚有研究表明，在肺癌患者的循環(huán)血液中，自身抗體能夠較CT提前5年發(fā)現(xiàn)腫瘤［11］。既往研究也提示多種自身抗體聯(lián)合測定可以有效檢測肺癌，尤其是在早期肺癌篩查中具有潛在價(jià)值［8，12］。但一些自身抗體也存在于其他疾病患者體內(nèi)，尤其是自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病和自身免疫性甲狀腺疾病等［13］。為排除以上疾病對AABs檢測的影響，本研究中所有患者在入組前均排除患有以上疾病。

在本研究納入的208例肺結(jié)節(jié)患者中，肺癌類型主要為周圍型腺癌（94.0%），且大多數(shù)是女性和非吸煙者，與肺腺癌的生物學(xué)特征一致。為了使肺癌組和良性肺疾病組之間的比較更為可靠，將肺癌組與良性肺疾病組受試者的性別、吸煙狀況、結(jié)節(jié)大小和結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)進(jìn)行匹配。遺憾的是，由于良性疾病組納入患者數(shù)量偏少，未能實(shí)現(xiàn)兩組的年齡匹配。

既往研究分析了7-AABs用于診斷肺癌的價(jià)值，顯示在Ⅰ～Ⅱ期NSCLC 中的敏感性為60%，特異性為91%［8］。本研究中，特異性和敏感性分別為87.9%和54.7%，與上述觀察結(jié)果相似。由于本研究中良性疾病組納入的人群數(shù)量較少，早期肺癌比例較高，因此敏感性和特異性稍低。本研究中，7-AABs 用于診斷肺癌的PPV 為92.1%，具有較好的診斷效能，當(dāng)7-AABs中2個(gè)或以上自身抗體同時(shí)為陽性時(shí)準(zhǔn)確性進(jìn)一步提高。同時(shí)，7-AABs 在早期肺癌的不同分期中無顯著性差異，在肺癌的不同密度、結(jié)節(jié)大小和組織學(xué)亞型中，也保持著相對穩(wěn)定的陽性檢出率。

一項(xiàng)研究顯示，7-AABs 較傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA、NSE 和CYFRA 21-1 具有更高的敏感性［14］，與本研究結(jié)果一致，并且兩者聯(lián)合檢測可以顯著提高診斷的敏感性，有助于肺癌的早期診斷。

美國胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)推薦將較為經(jīng)典的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型（Mayo 模型）用于肺結(jié)節(jié)良惡性的判定［15］，該模型包括年齡、吸煙、腫瘤史、結(jié)節(jié)大小、有無毛刺及結(jié)節(jié)是否位于上葉6 個(gè)因素。由于該模型采用的影像學(xué)資料多來源于X線胸片，診斷的敏感性較低。為有效提高肺癌的診斷能力，本研究采用單陽規(guī)則將7-AABs添加到Mayo模型中，提高了肺癌診斷的敏感性和PPV，并保持著穩(wěn)定的特異性，與Massion等［16］研究結(jié)果一致。采用雙陽規(guī)則聯(lián)合7-AABs 和Mayo 模型，提高了肺癌診斷的特異性和PPV，但敏感性有所下降。臨床醫(yī)生可以根據(jù)需要選擇單陽規(guī)則或雙陽規(guī)則將AABs加入Mayo模型，幫助早期識別高風(fēng)險(xiǎn)人群中的肺癌患者。

目前研究認(rèn)為在肺癌的發(fā)展過程中，如原位腺癌向微浸潤性腺癌進(jìn)展的中間階段，腫瘤細(xì)胞逐漸從附壁生長模式向浸潤性生長模式演變，結(jié)節(jié)邊緣可能出現(xiàn)分葉、毛刺或胸膜牽拉征，內(nèi)部也有可能出現(xiàn)空泡征［17］。本研究通過分析肺結(jié)節(jié)患者CT征象發(fā)現(xiàn)，7-AABs 陽性表達(dá)與短毛刺、空泡征相關(guān)，或有利于良惡性肺結(jié)節(jié)的鑒別。與Meng等［18］的研究結(jié)果存在差異（抗體陽性表達(dá)僅與胸膜凹陷征相關(guān)），這可能與螺旋CT 掃描儀器及判讀專家的經(jīng)驗(yàn)誤差有關(guān)，也可能與納入人群的偏倚有關(guān)，因?yàn)楸狙芯恐兴{入的所有人群均為住院患者，CT征象可能更具惡性腫瘤指向性。為排除上述因素的影響，后期可以采取多中心大樣本量進(jìn)行分析和驗(yàn)證。