谷詩(shī)濃，劉毓佳，王振杰，黃賽娥

（1.福建中醫(yī)藥藥大學(xué),福建 福州;2.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院,福建 福州）

0 引言

腦卒中是臨床疾病中一種常見的急危重癥，絕大部分腦卒中病例是由短暫性或永久性腦血管閉塞引起的局灶缺血性腦血管病[1]。是世界公認(rèn)第三大致死性疾病，臨床上具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的特征，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[2]，是屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇。

近幾年研究表明，細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)的基質(zhì)和細(xì)胞器通過溶酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解的過程，它是促進(jìn)細(xì)胞在各種壓力環(huán)境下存活的重要功能。自噬在腦缺血損傷中起著重要作用，它帶來(lái)的影響是具有兩面性的，與多種蛋白通路相關(guān)，也受復(fù)雜的因素調(diào)節(jié)[3-4]。隨著對(duì)細(xì)胞自噬的不斷了解，自噬的生物學(xué)作用與修復(fù)損傷神經(jīng)元功能方面的聯(lián)系逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，可在再灌注損傷早期利用溶酶體清除受損細(xì)胞器，發(fā)揮保護(hù)作用[5-6]。針刺在臨床治療和康復(fù)治療腦卒中疾病中廣泛使用，能有效改善損傷，提高患者生存質(zhì)量[7-9]。百會(huì)穴是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴，百脈之會(huì)，貫達(dá)全身。頭為諸陽(yáng)之會(huì)，百脈之宗，而百會(huì)為各經(jīng)脈氣會(huì)聚之處。穴性屬陽(yáng)，又于陽(yáng)中寓陰，故能通達(dá)陰陽(yáng)脈絡(luò)，連貫周身經(jīng)穴，對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體的陰陽(yáng)平衡起著重要的作用。故本研究選以電針百會(huì)穴為干預(yù)手段，通過觀察神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，探討電針百會(huì)穴是否通過調(diào)節(jié)自噬蛋白P62，從而對(duì)缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能起到保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只 清 潔 級(jí) 健 康 雄 性SD 大 鼠，體 質(zhì) 量 為（250±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司（許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-003）提供，在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SYXK（閩）2013-005）分籠飼養(yǎng)，溫度適宜，并進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，日夜12h 循環(huán)光照系統(tǒng)，給予自由飲食、飲水，并對(duì)大鼠進(jìn)行編號(hào)。當(dāng)大鼠體重為（280±10）g 進(jìn)行模型制作和電針干預(yù)。

1.2 主要試劑及儀器

線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司）；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；G6805-Ⅱ型電針治療儀(上海華誼公司)；P62抗體（Cell Singaling Technology 公司）；PMSF、BCA 蛋白定量試劑盒、電泳膠配液、超敏ECL 發(fā)光試劑盒（博士德生物有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制作

將60 只 體 質(zhì) 量 為（250±20）g 的SD 大 鼠 通 過 隨 機(jī) 數(shù)字表法分為四組，分別為空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組，每 組15 只。大 鼠 飼 養(yǎng) 至 體 重 為（280±10）g 時(shí) 開 始 造模，術(shù)前一天禁食不禁水12h。稱重后，按照3.3mL/1kg 進(jìn)行腹腔注射10%的水合氯醛麻醉。麻醉成功后以仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，酒精消毒備皮，沿頸部正中缺口剪開3-5cm切口，鈍性分離并充分暴露出頸總動(dòng)脈( common carotid artery,CCA)、頸 外 動(dòng) 脈( external carotid arter,ECA)、頸 內(nèi) 動(dòng)脈( internal carotid artery,ICA)。假手術(shù)組只進(jìn)行血管分離后縫合并不插入線栓，模型組與電針組參照Longa 法[10]并加以改良。游離ECA 主干,結(jié)扎遠(yuǎn)心端并將其離斷。在ECA 殘端用眼科剪剪開一“V”型小口,剪口之前用微動(dòng)脈夾夾閉CCA 和ICA。將線栓小心地從切口插入。去除ICA 上的動(dòng)脈夾，讓線栓進(jìn)入，以遇到輕微阻力為準(zhǔn)，進(jìn)入深度約為18-20mm。線栓成功進(jìn)入后，阻塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈開口，縫合前觀察2-5min 無(wú)滲血出血情況后可進(jìn)行縫合。阻塞2h 后，將線栓緩慢抽出線栓至頸總動(dòng)脈分叉處。麻醉期間注意保溫直至動(dòng)物蘇醒。手術(shù)結(jié)束待動(dòng)物蘇醒2h 后參照Z(yǔ)ea Longa 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)老鼠進(jìn)行評(píng)分判斷手術(shù)是否成功。0 分：提起鼠尾，可伸展雙上肢，無(wú)神經(jīng)缺損癥狀；1 分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2 分：提起鼠尾對(duì)側(cè)前肢內(nèi)旋，肩內(nèi)收，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4 分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。神經(jīng)功能評(píng)分為1-3 分的大鼠視為造模成功，納入實(shí)驗(yàn)，0分和4 分者剔除。

1.4 選穴及干預(yù)方法

待造模成功后，將大鼠固定至鼠板上進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，從第二天開始對(duì)電針組進(jìn)行電針干預(yù)，空白組、假手術(shù)組和模型組每日同等條件抓取不進(jìn)行干預(yù)。腧穴定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]，“百會(huì)”位于頂骨正中，兩耳尖連線中點(diǎn)，使用0.5 寸華佗牌針灸針，向前斜刺2 mm。進(jìn)針2-5mm，選擇疏密波，頻率1/20Hz，電流強(qiáng)度1-3mA，30min/次，1 次/天。選擇每天上午固定時(shí)段進(jìn)行電針，干預(yù)7 天后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死、取材。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

造模成功后，參照Z(yǔ)ea Longa 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分為神經(jīng)功能無(wú)障礙；1 分為提尾時(shí)向?qū)?cè)前肢屈曲；2 分為不能直行，大鼠向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3 分為行走困難，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4 分為嚴(yán)重意識(shí)障礙，無(wú)自發(fā)活動(dòng)或意識(shí)不清。電針組連續(xù)干預(yù)7 天，每次針刺結(jié)束2h 后評(píng)分、記錄，其余3 組同等條件抓取，不進(jìn)行干預(yù)，記錄評(píng)分。

1.6 蛋白免疫印跡（WesternBlot）

7 天電針干預(yù)后，每組隨機(jī)取出5 只大鼠，腹腔麻醉，迅速斷頭取腦，分離取出大鼠缺血半暗帶組織，放于-80℃冰箱保存。對(duì)組織稱重，加入裂解液，BCA 法檢測(cè)樣本蛋白濃度。將計(jì)算好的上樣量加入12%的分離膠和濃縮膠中電泳分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫奶粉封閉1h。封閉后放入一抗4℃過夜，TBST 洗3×5min，放入二抗室溫?fù)u床孵育1h。TBST 洗3×5min，按照A 液：B 液=1 ∶1 的比例配置ECL 顯影液，將PVDF 膜充分浸入顯影液后放入凝膠成像儀器內(nèi)顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用 LSD 法（方差齊）或 Dunnett’s T3 法（方差不齊），以P ≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

模型制備后，模型組與電針組相比較于假手術(shù)組和空白組均有神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)（P＜0.05）。干預(yù)7d 后，模型組損傷比較嚴(yán)重，電針組損傷評(píng)分明顯降低（P＜0.05），表明電針對(duì)缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷有改善意義（見表1）。

表1 各組大鼠Zea-Longa 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分比較，

表1 各組大鼠Zea-Longa 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分比較，

組別 n 缺血再灌注2h 缺血再灌注7d空白組 15 0 0假手術(shù)組 15 0 0模型組 15 2.13±0.67 2.38±0.78電針組 15 2.17±0.70 1.57±0.65

2.2 各組大鼠P62 蛋白表達(dá)比較

P62 的灰度值的計(jì)算以β-actin 為內(nèi)參，與空白組和假手術(shù)組比較，模型組P62 表達(dá)增多。7d 干預(yù)后，電針組與模型組相比較P62 表達(dá)降低（P＜0.05）（見圖1、圖2）。

圖1 Western blot 法檢測(cè)各組大鼠缺血半暗帶皮層Beclin-1 蛋白的表達(dá)

圖2 各組大鼠缺血半暗帶皮層Beclin-1 蛋白的表達(dá)水平比較

3 討論

近年隨著人民生活方式轉(zhuǎn)變和人口老齡化加劇，缺血性腦卒中的發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢(shì)，缺血性腦卒中更是十分重大的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重加重了全球疾病負(fù)擔(dān)。是世界范圍內(nèi)的第三大死因(僅次于冠心病和癌癥)，其中87%發(fā)生在低收入和中等收入國(guó)家[12]，為更患者尋找簡(jiǎn)易價(jià)廉的醫(yī)療手段用于防治缺血性腦卒中疾病的需求迫在眉睫，而祖國(guó)醫(yī)學(xué)迄今為止在防治心腦血管疾病中仍發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，臨床上針刺的療效有目共睹，因此本研究選取傳統(tǒng)針刺作為干預(yù)手段。同時(shí)研究表明電針可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)通路、炎癥反應(yīng)、蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡等多方面改善缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能損傷[13-16]，但具體機(jī)制并不明確。對(duì)于缺血性中風(fēng)的研究，仍然有必要從多角度、多靶點(diǎn)尋找治療手段。

自噬在缺血再灌注損傷中的作用是一種高度保守的自我清除與降解的動(dòng)態(tài)平衡過程。當(dāng)機(jī)體受到各種損害導(dǎo)致細(xì)胞器受損時(shí)，會(huì)激活自噬以降解受損細(xì)胞器和清除蛋白質(zhì)[17]。在缺血再灌注損傷中，成熟的自噬體通過Ras 相關(guān)蛋白7(Rab)與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并最終在自噬底物蛋白P62/(sequestosomel,SQSTM1)的參與下被降解。微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociatedprotein 1 light chain3,LC3)參與自噬體的形成，并在自噬體的降解中發(fā)揮輔助作用，P62 參與自噬的降解，故P62 蛋白與自噬密切相關(guān)?？梢酝ㄟ^觀察P62 的變化來(lái)評(píng)估自噬的形成，了解受損組織內(nèi)的自噬情況[18-19]。本研究在缺血再灌注損傷后發(fā)現(xiàn)P62 含量明顯下降，而在電針干預(yù)后，電針組與模型組比較神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分表明大鼠損傷有效改善，P62 含量上升。表明P62 蛋白可能參與了神經(jīng)功能的保護(hù)機(jī)制，為臨床治療提供更多可能的靶點(diǎn)，對(duì)于臨床合理推廣針刺治療缺血性卒中具有重要意義。