羅秋水 謝 升 湯凱潔 熊建華 杜 娟

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045)

魚(yú)腥草(HouttuyniaecordataThunb)，又名紫蕺，野花麥，折耳根等，屬三白草科蕺菜屬，莖呈扁圓柱形，葉片卷折皺縮，搓碎有魚(yú)腥氣味，多分布于長(zhǎng)江流域和南方省區(qū)[1]。魚(yú)腥草富含蛋白質(zhì)、油脂、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有鈣、磷、錳、鈉、鉀等礦物素，同時(shí)具有能清熱解毒、消腫療瘡、利尿除濕、清熱止痢、健胃消食等功效?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，具有抗菌、抗病毒、提高機(jī)體免疫力、利尿等作用，是國(guó)家衛(wèi)生部確定為“既是食品，又是藥品”的資源之一[2]。

大量研究表明，藥食兩用的植物提取物均有不同程度的抗氧化作用[3]，而目前對(duì)魚(yú)腥草的研究更多集中于有效成分的提取和鑒定，對(duì)魚(yú)腥草揮發(fā)油的抗氧化作用研究及應(yīng)用尚處于完善階段[4-6]。本實(shí)驗(yàn)先選取了較為常用的DPPH·法和鄰二氮菲-Fe2+分光光度法來(lái)評(píng)定魚(yú)腥草揮發(fā)油的體外抗氧化活性，再以過(guò)氧化值為指標(biāo)，采用Schaal烘箱法，評(píng)定魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)五種食用油的抗氧化效果，旨在為魚(yú)腥草作為一種天然抗氧化劑及其綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

魚(yú)腥草：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)；豬油、花生油、大豆油、菜籽油、葵花籽油：市售；抗壞血酸、草酸、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、H2O2、硫代硫酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、重鉻酸鉀、碘化鉀、可溶性淀粉、冰乙酸、三氯甲烷均為分析純；SB-3200DTD超聲波清洗機(jī)；LD4-20 低速離心機(jī)；UV-9100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；GZX-9246MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)腥草揮發(fā)油的制備

將魚(yú)腥草清除黃葉、洗凈，分離莖、葉，烘干粉碎后放入干燥器中備用。分別稱取一定量莖、葉樣品粉末，用70%的乙醇溶液按料液比1∶50對(duì)樣品進(jìn)行水浴提取，提取時(shí)間為2 h、提取溫度為60 ℃，室溫下靜置10 min后，離心15 min，轉(zhuǎn)速4 000 r/min。過(guò)濾取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮，經(jīng)乙醚和石油醚萃取后干燥，即得到魚(yú)腥草揮發(fā)油。

1.2.2 魚(yú)腥草揮發(fā)油不同濃度的配制

準(zhǔn)確稱取0.25 g魚(yú)腥草揮發(fā)油，用無(wú)水乙醇定容至25 mL容量瓶中，得10 mg/mL魚(yú)腥草揮發(fā)油乙醇溶液，并以此為基準(zhǔn)，用無(wú)水乙醇稀釋得到200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL魚(yú)腥草揮發(fā)油乙醇溶液濃度系列，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗壞血酸不同濃度的配制

準(zhǔn)確稱取0.25 g抗壞血酸，分別用超純水及2%草酸溶液定容至25 mL容量瓶中，得10 mg/mL抗壞血酸水溶液及草酸溶液，并以此為基準(zhǔn)，用超純水及2%草酸溶液稀釋得到200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL抗壞血酸水溶液及草酸溶液濃度系列，存于避光處備用。

1.2.4 對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用

準(zhǔn)確稱取0.25 g鄰二氮菲，用無(wú)水乙醇定容至250 mL，得到5 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液；取0.19 g硫酸亞鐵晶體，蒸餾水定容至250 mL，得到5 mmol/L硫酸亞鐵溶液；取19 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4溶液和81 mL 0.2 mol/L的 Na2HPO4溶液，充分混合得到pH=7.4的0.2 mol/L磷酸緩沖溶液。

將配備好的魚(yú)腥草揮發(fā)油乙醇溶液、抗壞血酸水溶液系列溶液及相應(yīng)試劑按表1依次添加，混勻后37 ℃水浴60 min，分別在536 nm處測(cè)吸光值，平行測(cè)定2次，結(jié)果取平均值，按公式計(jì)算清除率：

清除率=[A(樣)-A(損)/A(未)-A(損)]×100%

式中：A(損)為未添加樣品清除羥自由基所得損傷管的吸光值；A(未)為用蒸餾水代替損傷管中的雙氧水、未發(fā)生反應(yīng)所得未損傷管的吸光值。

表1 羥基自由基實(shí)驗(yàn)加樣表

1.2.5 對(duì)1,1-二苯基-2-苯基自由基(DPPH·)的清除作用

準(zhǔn)確稱取DPPH·10 mg，用無(wú)水乙醇定容至100 mL容量瓶，得10% DPPH·無(wú)水乙醇溶液；再取10% DPPH·無(wú)水乙醇溶液5 mL，稀釋成1% DPPH·無(wú)水乙醇溶液，存于避光處備用。

將配備好的魚(yú)腥草揮發(fā)油乙醇溶液、抗壞血酸草酸溶液系列溶液及相應(yīng)試劑按表2依次添加，反應(yīng)10 min后分別于517 nm處測(cè)定吸光值。重復(fù)測(cè)定2次，結(jié)果取平均值，按公式計(jì)算自由基清除率：

清除率=[1-(Ai-Aj)/ (A-A0)] ×100%

表2 DPPH·實(shí)驗(yàn)加樣表

1.2.6 油脂加速氧化實(shí)驗(yàn)

采用Schaal烘箱法強(qiáng)制加速氧化[7]，將一定量的樣品、抗壞血酸或混合物加入50 g油樣混勻，置于100 mL燒杯中，敞口放入63 ℃的烘箱中恒溫保存，每12 h攪拌一次，并變換位置，每24 h測(cè)定一次各油樣的過(guò)氧化值，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，結(jié)果取平均值。

1.2.7 過(guò)氧化值的測(cè)定

過(guò)氧化值是常用來(lái)表示油脂被氧化程度的一種指標(biāo)，過(guò)氧化值越大，說(shuō)明油脂被氧化的程度越大。本實(shí)驗(yàn)按GB 5009.227—2016測(cè)定過(guò)氧化值，用過(guò)氧化物相當(dāng)于碘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示過(guò)氧化值，基本操作：稱取試樣2～3 g，置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，使試樣完全溶解，準(zhǔn)確加入1.00 mL飽和碘化鉀溶液，塞緊瓶蓋，輕輕振搖0.5 min，在暗處放置3 min，取出，加100 mL水，搖勻后立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的碘，滴定至淡黃色時(shí)，加1 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定并振搖至溶液藍(lán)色消失為終點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)羥基自由基的清除作用

鄰二氮菲-Fe2+水溶液中的Fe2+經(jīng)Fenton反應(yīng)：Fe2++H2O2→ Fe3++OH-+OH·可產(chǎn)生羥基自由基，而氮菲-Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，其536 nm處最大吸收峰消失，由此可通過(guò)比較536 nm處溶液吸光值的變化來(lái)反映對(duì)羥基自由基的清除作用[8]，清除率越大，說(shuō)明清除自由基能力越強(qiáng)。

由圖1可知，魚(yú)腥草揮發(fā)油以及抗壞血酸對(duì)羥基自由基的清除作用均隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，但抗壞血酸水溶液對(duì)羥基自由基的清除作用要優(yōu)于魚(yú)腥草揮發(fā)油。當(dāng)濃度在200～800 μg/mL范圍內(nèi)，二者對(duì)羥基自由基清除作用均呈現(xiàn)劑量～效應(yīng)關(guān)系，濃度越高，清除率越大，并接近線性相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度在800～1 200 μg/mL時(shí)，隨著濃度升高清除率依舊上升，但整體趨于平緩；在1 200 μg/mL時(shí)，抗壞血酸水溶液對(duì)羥基自由基清除率達(dá)到76.05%，魚(yú)腥草揮發(fā)油的清除率達(dá)到62.72%。

圖1 魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)羥基自由基的清除作用

2.2 魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除作用

DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其溶液具有特征的紫紅色團(tuán)吸收峰，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析[9]。

由圖2可知，質(zhì)量濃度在200～1 200 μg/mL時(shí)，魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除作用隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增大；而抗壞血酸草酸溶液濃度在200～1 200 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，清除率在92%上下浮動(dòng)。由此可見(jiàn)，在1 200 μg/mL時(shí)，抗壞血酸草酸溶液對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到93.86%，魚(yú)腥草揮發(fā)油的清除率達(dá)到72.43%。

圖2 魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除作用

2.3 不同部位及混合魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)大豆油的抗氧化作用

將油樣質(zhì)量0.6%的莖部、葉部魚(yú)腥草揮發(fā)油分別加入大豆油中，進(jìn)行氧化實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做空白對(duì)照，測(cè)定各油樣的過(guò)氧化值，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同部位及混合魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)大豆油的抗氧化作用

由圖3可知，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，各實(shí)驗(yàn)油樣的過(guò)氧化值均呈現(xiàn)增大趨勢(shì)；其中添加了混合魚(yú)腥草揮發(fā)油的油樣過(guò)氧化值最低，其次為葉部，然后是莖部，且都比空白樣品的低。由此可知，葉部魚(yú)腥草揮發(fā)油抗氧化效果要比莖部的好。

2.4 魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)5種食用油的抗氧化作用

將油樣質(zhì)量0.6%的魚(yú)腥草揮發(fā)油分別加入豬油、花生油、大豆油、葵花籽油和菜籽油中，進(jìn)行氧化實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做空白對(duì)照，測(cè)定各油樣的過(guò)氧化值，結(jié)果表明各油樣隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，其過(guò)氧化值均有一定程度增大，添加了魚(yú)腥草揮發(fā)油的油樣的過(guò)氧化值，均比空白油樣要低，說(shuō)明魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)5種食用油均具有一定抗氧化的作用；5種油樣在相同環(huán)境下的氧化速度有所不同，其中以豬油的氧化速度最慢，花生油的氧化速度最快?；趯?duì)大豆油的抗氧化效果相對(duì)明顯和穩(wěn)定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以大豆油作為對(duì)象進(jìn)行研究。

2.5 不同劑量魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)大豆油的抗氧化作用

將油樣質(zhì)量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的魚(yú)腥草揮發(fā)油分別加入大豆油中，進(jìn)行氧化實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做空白對(duì)照，測(cè)定各油樣的過(guò)氧化值，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同劑量魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)大豆油的抗氧化作用

由圖4可知，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，添加了不同劑量魚(yú)腥草揮發(fā)油的油樣過(guò)氧化值呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，且均比空白油樣要低；隨著魚(yú)腥草揮發(fā)油添加劑量的增大，相應(yīng)油樣過(guò)氧化值減小，說(shuō)明在以上劑量范圍內(nèi)，魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)大豆油的抗氧化作用具有劑量和效應(yīng)關(guān)系，劑量越高，抗氧化效果越好。

2.6 魚(yú)腥草揮發(fā)油與抗壞血酸對(duì)大豆油的抗氧化作用

將油樣質(zhì)量0.6%的魚(yú)腥草揮發(fā)油、抗壞血酸和兩者等比混合分別加入大豆油中，進(jìn)行氧化實(shí)驗(yàn)，做空白對(duì)照，測(cè)定各油樣的過(guò)氧化值，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，各實(shí)驗(yàn)油樣的過(guò)氧化值均呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，添加抗壞血酸的油樣過(guò)氧化值比魚(yú)腥草揮發(fā)油的更低，抗壞血酸、魚(yú)腥草揮發(fā)油等比混合的最低；由此可知，抗壞血酸、魚(yú)腥草揮發(fā)油等比混合抗氧化效果最好，其次是抗壞血酸和魚(yú)腥草揮發(fā)油，可能的原因是抗壞血酸、魚(yú)腥草揮發(fā)油混合呈現(xiàn)協(xié)同增效作用，具有更好的抗氧化作用。

圖5 魚(yú)腥草揮發(fā)油與抗壞血酸對(duì)大豆油的抗氧化作用

3 結(jié)論

魚(yú)腥草揮發(fā)油在200～1 200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，對(duì)羥基和DPPH·兩種自由基的清除作用均有增強(qiáng)，其中魚(yú)腥草揮發(fā)油的質(zhì)量濃度為1 200 μg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基清除率達(dá)到62.72%，對(duì)1,1-二苯基-2-苯基自由基清除率達(dá)到72.43%。魚(yú)腥草葉部揮發(fā)油對(duì)大豆油的抗氧化效果優(yōu)于莖部；魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)5種食用油均具有一定的抗氧化作用；5種油樣在相同環(huán)境下的氧化速度有所不同，其中以豬油的氧化速度最慢，花生油的氧化速度最快；在一定劑量范圍內(nèi)，魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)大豆油的抗氧化作用具有劑量～效應(yīng)關(guān)系，劑量越高，抗氧化效果越好；魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)大豆油的抗氧化作用弱于抗壞血酸，而兩者復(fù)配對(duì)大豆油的抗氧化性具有協(xié)同增效作用。綜上所述，魚(yú)腥草確實(shí)可以作為一種效果較好的天然抗氧化劑。