逄曉陽，朱 青，蘆 晶，張書文，劉 瀏，楊 蘭，李偉勛，呂加平

(中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌，這類細菌在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性，至少包含18個屬，共200多個種。乳酸菌是世界公認的對人類健康有益的安全菌株，在代謝過程中合成的抗菌肽有溶菌作用，故可作為天然食品防腐劑；乳酸菌代謝產(chǎn)生的大量胞外多糖和有機酸有助于發(fā)酵產(chǎn)品風味和質(zhì)地的形成，乳酸菌具有較強的耐酸、耐鹽能力，加入腌制品中可增加風味防止食物敗壞[1]，廣泛應用于食品工業(yè)中；乳酸菌也是存在于人體消化道內(nèi)的益生菌，在生長過程產(chǎn)生的有機酸和分泌的胞外抗菌肽，可抑制病原微生物的生長繁殖、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的平衡[2]，從而對宿主的營養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、應激反應等產(chǎn)生作用。Yin等[3]研究證明，乳酸菌可降低血液中膽固醇含量，且具有抑制腸道炎癥的潛力，所以在醫(yī)學領域也有重要應用前景；此外，隨著高通量測序技術的飛速發(fā)展，乳酸菌的功能基因組研究也取得了矚目進展，成為研究功能基因、遺傳分類學等的理想材料。乳酸菌在理論研究與生產(chǎn)實踐都具有重要的應用價值。

近年研究發(fā)現(xiàn)，群體感應(quorum sensing,QS)系統(tǒng)會調(diào)控乳酸菌的多項重要生理功能，如調(diào)控菌體生物膜的形成[4]、抗菌肽的合成[5]、胞外酶的合成[6]、腸道定殖能力[7]等等。乳酸菌QS系統(tǒng)通過細胞密度的改變進行信息傳遞，同時根據(jù)信號分子的供體和受體是否為同一種菌，將群體感應系統(tǒng)分為種內(nèi)信息交換系統(tǒng)和種間信息交換系統(tǒng)[8-9]。種內(nèi)信息交換以自誘導肽(AIP)作為信號分子，前體AIP被轉(zhuǎn)錄修飾形成成熟的AIP分子[10]，然后借助位于細胞膜上的ABC(ATP-binding cassette transporter)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)或其他膜通道蛋白轉(zhuǎn)運達到細胞外[11]，當分泌到周圍環(huán)境中AIPs的濃度達到某個閾值時，位于細菌細胞膜上的雙組分系統(tǒng)(two component signaling system，TCS)會被AIPs所激活，通過磷酸化的方式將群體感應信號傳遞給下游靶基因，并調(diào)控相應靶基因的表達[12]，有些細菌的sRNA也參與在這個信號的傳遞過程中。另一方面，種間信號傳導是不同種屬細菌之間的信號交流模式，目前發(fā)現(xiàn)該類交流模式常用的信號分子是AI-2(autoinducer-2)類信號分子。研究表明，無論革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中都存在通過AI-2信號分子感應環(huán)境變化的AI-2/LuxS QS調(diào)控機制[13-15]，經(jīng)證實，參與QS的luxS基因可調(diào)控乳酸菌的許多生理活性[16]。目前被證實有兩種合成AI-2的方法，一種是使用蛋氨酸作為起始原料的四步酶促反應途徑，另一種方法則是基于細菌的半生物合成途徑(圖1)。

細菌的群體感應系統(tǒng)包括AIPs 信號分子和TCS。典型的TCS由組氨酸蛋白激酶(HPK)和反饋調(diào)節(jié)蛋白(RR)組成。表1列出了已報道的乳酸菌感應信號分子及其參與的生理功能。

圖1 AI-2合成途徑[15]Fig.1 AI-2 synthesis pathway[15]

表1 乳酸菌群體感應信號分子Table 1 Lactic acid bacteria quorum sensing signal molecule

圖2 生物膜形成過程[26]Fig.2 Biofilm formation process[26]

1 群體感應系統(tǒng)調(diào)控乳酸菌生物膜的形成

生物膜是一種高度組織化的微生物菌落聚集體，由黏附在惰性物體或活生物體上的細菌形成，并被細菌自身分泌的胞外基質(zhì)包裹。除了水和細菌外，生物膜還含有細菌分泌的大分子多聚物、吸附的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等。它是細菌為了抵抗不利環(huán)境而形成的一種自我保護形式，除了為細菌提供黏附力還賦予細菌高度的疏水性。在自然界中，除了少數(shù)浮游生物不合成生物膜以外，大多數(shù)的細菌都以生物膜的形式存在。因為生物膜可提高乳酸菌對胃酸和膽鹽滲透的抵抗力，因此推測乳酸菌生物膜的形成可能間接影響其益生功能的發(fā)揮。

乳酸菌生物膜的形成是細菌在物體表面從可逆黏附轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡骛じ讲⒎e聚的過程，其通過群體感應系統(tǒng)和細菌間的相互作用來調(diào)控。由于形成生物膜的細菌與生物膜直接接觸，所以與浮游細菌相比，其生理功能已經(jīng)發(fā)生了巨大改變。另外，位于生物膜不同位置的細菌也有很大差異，一般來說位于生物膜表層的細菌更容易接觸到環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，所以分裂更快、代謝更活躍，而位于膜內(nèi)層的細菌只能通過特定運輸通道獲得營養(yǎng)物質(zhì)、排泄代謝產(chǎn)物，因此營養(yǎng)匱乏，易受到積累的代謝產(chǎn)物的毒害。所以內(nèi)層細菌代謝緩慢，多處于休眠期。生物膜的形成大致分為以下幾個過程(圖2)：首先，細菌通過鞭毛運動初步附著在物體表面，此時的黏附依賴于細胞表面的理化性質(zhì)，膜尚未形成，是一個可逆的黏附。其次，聚集的細菌開始向環(huán)境中分泌胞外基質(zhì)，其主要成分為多糖類、脂蛋白、纖維蛋白以及細胞外DNA等，在這些多糖類黏性基質(zhì)的介導下，細菌黏附力增強，菌體也越來越多，形成了不可逆黏附。最后，隨著胞外基質(zhì)的增加，菌體的堆積，菌落形成有一定組織結(jié)構(gòu)的聚集體，生物膜逐漸成熟。其中，最關鍵的步驟是：膜表面的細菌分泌更多的胞外基質(zhì)提高細菌的附著力，進一步提高其在物體表面形成生物膜的能力，已經(jīng)有研究證明，群體感應系統(tǒng)可通過感知胞外化學信號的濃度改變從而調(diào)控細胞膜的形成，在細菌黏附積累過程中發(fā)揮重要作用。

1.1 群體感應系統(tǒng)與細菌黏附的關系

促進生物膜形成和成熟的關鍵因素是菌體的累積和菌體黏附性的增強。生物膜形成能力與細胞黏附之間的關系已經(jīng)在一些研究中得到證明。

Salas-Jara等[26]研究表明，在加了粘蛋白且不加葡萄糖的MRS培養(yǎng)基中，鼠李糖乳桿菌形成生物膜的能力提高了20%；在高濃度的膽汁和黏液中，植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌可以形成生物膜。Lebeer等[27]得到了一個鼠李糖乳桿菌突變株，該菌株含有與細胞外多糖合成相關的基因，與野生型相比，該基因的突變株有更高的生物膜形成能力。此外，已經(jīng)有關于QS系統(tǒng)的信號分子可以影響乳酸菌黏附的報道，luxS是AI-2分子合成的關鍵酶基因，Buck等[28]發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，luxS基因缺失的嗜酸乳桿菌突變體黏附至腸上皮細胞的能力降低了58%。Sturme等[12]在植物乳桿菌WCFS1中發(fā)現(xiàn)了與金黃色葡萄球菌agrBDCA系統(tǒng)同源的lamBDCA系統(tǒng)。在agrBDCA系統(tǒng)調(diào)控生物膜形成的過程中，AgrD充當合成有獨特硫酯環(huán)結(jié)構(gòu)的八肽型AIP前體，并通過AgrB膜蛋白被轉(zhuǎn)運到細胞外。隨著細胞密度的增加，AIP的濃度逐漸增加，結(jié)合組氨酸激酶受體AgrC并將其磷酸化，然后激活應答調(diào)控劑AgrA?；罨腁grA與總調(diào)控劑SarA協(xié)同作用激活了細胞內(nèi)RNAII(與QS擴增相關的基因)和RNAIII(與胞外蛋白合成相關的基因)的轉(zhuǎn)錄[29](圖3)。在植物乳桿菌WCFS1的lamBDCA系統(tǒng)中，LamD是一種自我誘導的前體肽，被LamB加工蛋白加工成LamD衍生肽，兩者均由lamBD基因表達。LamD衍生肽是類似于agr系統(tǒng)中AIP結(jié)構(gòu)的環(huán)狀硫代內(nèi)酯五肽，被命名為LamD558。Sturme等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Lam系統(tǒng)參與了植物乳桿菌表面黏附的調(diào)控，這表明乳桿菌中的agr類QS系統(tǒng)(lamBDCA系統(tǒng))在改善細胞黏附方面具有不可忽略的作用。因此QS系統(tǒng)可以為乳酸菌生物膜的形成提供一些證據(jù)。

圖3 金黃色葡萄球菌的agrBDCA系統(tǒng)[29]Fig.3 agrBDCA system of Staphylococcus aureus[29]

1.2 群體感應系統(tǒng)誘導生物膜形成的機制

群體感應系統(tǒng)可以介導乳酸菌生物膜的形成。Lebeer等[27]的一項研究發(fā)現(xiàn)，LuxS基因缺失的鼠李糖乳桿菌突變株形成生物膜的能力下降，若在突變株中添加AI-2前體分子或野生型菌株，雖無法使突變株恢復到原始形成生物膜水平，但可部分彌補突變菌株對生物膜形成的影響。乳桿菌自生肽信號分子在乳桿菌生長過程中表達水平較低，但當細胞密度達到某個閾值時，它將與TCS中的受體激酶HPK結(jié)合，進行自我磷酸化，然后活化反應的調(diào)控劑(RR)被磷酸基團轉(zhuǎn)移，從而導致動態(tài)范圍的自身誘導。群體感應系統(tǒng)介導的乳酸菌生物膜的形成在生物膜的生長和傳播中起了重要作用，生物膜的生長期指細菌不可逆附著和積累的時期，該階段的特征是：向細胞外分泌黏性基質(zhì)、乳酸菌大量黏附和聚集、通過信號分子感知細胞密度，以及在達到閾值后細胞轉(zhuǎn)錄特定RNA從而促進生物膜的成熟。生物膜成熟后，固有細菌的代謝廢物只能通過間隙水通道運出，當大量的細菌在有限空間中附著在生物膜上時，會發(fā)生代謝廢物的積累以及種內(nèi)或種間競爭，在此過程中，細菌QS系統(tǒng)通過不利環(huán)境因素激活特異基因的表達，調(diào)控細菌生物膜的部分脫落。因此，細菌又變成浮游形式，從而防止了細菌的過度生長、代謝廢物的積累和營養(yǎng)的缺乏。

2 群體感應系統(tǒng)調(diào)控乳酸菌自溶

乳酸菌是生產(chǎn)酸奶和其他乳制品常用的發(fā)酵劑。在發(fā)酵過程中，乳酸菌菌體會隨著發(fā)酵密度的增加出現(xiàn)菌體裂解的現(xiàn)象，該現(xiàn)象稱為乳酸菌的自溶。乳酸菌的自溶會對發(fā)酵乳制品的品質(zhì)產(chǎn)生較大影響，近年來引起了越來越多的關注[31-32]。在奶酪生產(chǎn)過程中，奶酪的成熟階段對于確定最終產(chǎn)品的風味和質(zhì)地至關重要[33]，自然情況下該過程最少需要3周，有的甚至要持續(xù)超過2年，所以自然成熟奶酪的生產(chǎn)是一個漫長的過程[34]。加快奶酪成熟的一般做法有：適當提高發(fā)酵溫度、選用合適的發(fā)酵劑[35]和補充酶制劑[36]。實踐證明，選用合適的乳酸菌發(fā)酵劑是安全、成本低廉且效果顯著的一種解決方案，這是由于發(fā)酵菌株自溶會釋放出胞內(nèi)酶，這種酶有促進肽鏈的降解和去除苦味的作用[37-40]，可以將奶酪中的大分子蛋白降解為短肽甚至是氨基酸[37]。因此，在加快奶酪成熟過程中定向調(diào)控發(fā)酵菌株的自溶非常重要。在生產(chǎn)酸奶過程中，乳酸菌自溶可顯著降低發(fā)酵終產(chǎn)品中的活菌數(shù)量[41]，因此需要開發(fā)低自溶度的發(fā)酵劑菌株來生產(chǎn)酸奶、益生菌等飲品。以上干酪和酸奶的案例都證明了乳酸菌自溶對發(fā)酵乳品工業(yè)會產(chǎn)生重要影響，因此揭示其自溶的分子機制，并根據(jù)生產(chǎn)實踐需要定向調(diào)控其自溶的進程具有重要意義。

細菌通常通過雙組分系統(tǒng)(TCS)感知環(huán)境中的各種變化并對其作出反應[41]。在大多數(shù)細菌中都發(fā)現(xiàn)了TCS，它主要是作為環(huán)境感受器和細胞信號傳導因子[42-44]。對乳酸菌進行全基因組測序和基因功能分析后發(fā)現(xiàn)，每個乳酸菌基因組均編碼多個TCS系統(tǒng)[45]，但是很多TCS涉及的生物學功能還沒有被系統(tǒng)研究。目前已有的研究證明有的TCS與細菌素的合成有關[46]，有的TCS與耐酸性有關[45]，有的TCS與膽汁耐受性有關，還有的TCS系統(tǒng)(源于植物乳桿菌lamBDCA)與菌體黏附性有關。

以保加利亞乳桿菌BAA-365為例，要研究一個未知TCS系統(tǒng)，通常要采用如下的方法：從NCBI和Pfam數(shù)據(jù)庫中獲取組氨酸蛋白激酶(HPK)和反饋調(diào)節(jié)蛋白(RR)保守結(jié)構(gòu)域的hmm文件，用Hmmer軟件掃描保加利亞乳桿菌BAA-365的蛋白質(zhì)組序列，以預測可能的HisKA、HATPase-c和Response-reg位點。結(jié)果如表2所示，總共發(fā)現(xiàn)了7個HPK和7個RR。

表2 保加利亞乳桿菌BAA-365 TCS系統(tǒng)的功能預測[47]Table 2 Functional prediction of L.bulgaricus BAA-365 TCS system[47]

注：L.aci—Lactobacillusacidophilus;E.fae—Enterococcusfaecalis;L.sak—Lactobacillussakei;L.cri—Lactobacilluscrispatus;L.equ—Lactobacillusequicursoris。

保加利亞乳桿菌BAA-365共有7個TCS系統(tǒng)，其中有5個TCS已被報道分別與膽汁耐受性、萬古霉素抗性等相關，還有2個TCS的功能未知。為了研究這2個TCS系統(tǒng)潛在的生物學功能，筆者運用分子生物學技術敲除功能未知的TCS編碼基因，結(jié)果顯示，與野生型BAA-365相比，LBUL_RS00115基因突變體的自溶速率明顯較低，這表明LBUL_RS00115(WP_011677872.1的編碼基因)與保加利亞乳桿菌的自溶相關(圖4)[17]。

此外，通過酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)，在WP_011677872.1和WP_011677871.1之間存在直接磷酸化的相互作用。以上結(jié)果表明，WP_011677872.1/WP_011677871.1的TCS與保加利亞乳桿菌菌體自溶有關?？偟膩碚f，保加利亞乳桿菌在其生長過程中會向周圍環(huán)境分泌一個信號肽分子，當周圍環(huán)境中信號肽的濃度達到或超過閾值時，位于細胞壁上的組氨酸蛋白激酶vicK就會啟動磷酸化反應，進而反饋調(diào)節(jié)蛋白vicR磷酸化。磷酸化的vicR與位于lytM、ssaA和atlA的RNA聚合酶結(jié)合，促進了這3個基因的表達，且表達的肽聚糖水解酶加速了細胞壁的裂解(圖5)[47]。

圖4 菌體自溶度檢測結(jié)果[47]Fig.4 Autolysis data[47]

圖5 保加利亞乳桿菌通過vicKR途徑調(diào)控菌體自溶[47]Fig.5 Lactobacillus bulgaricus regulates autolysis through vicKR pathway[47]

圖6 乳鏈球菌素生物合成的基因簇Fig.6 Organization of Nisin biosynthetic gene clusters

3 群體感應系統(tǒng)調(diào)控羊毛硫抗生素合成

許多乳酸菌都可合成羊毛硫抗生素，該過程通過細胞密度依賴性的方式受到調(diào)控。羊毛硫抗生素通常在對數(shù)生長中期到后期開始合成，在靜止期達到最大值。研究顯示，在許多情況下這種調(diào)控模式都涉及小肽類信號分子(信號肽)[25]。乳酸菌在生長過程中會不斷向周圍環(huán)境中分泌這些信號肽，當濃度達到一定閾值時，信號肽與其關聯(lián)受體(組氨酸蛋白激酶)相互作用，通過跨膜信號的傳遞，觸發(fā)羊毛硫抗生素的高效表達。群體感應通過信號分子濃度的介導感知菌體密度，當菌體密度增加時，信號分子的濃度也會隨之增加，激活信號轉(zhuǎn)導等一系列級聯(lián)反應調(diào)控細菌素的表達。

羊毛硫抗生素是最常見的乳鏈球菌素，它是一類小分子熱穩(wěn)定段肽，具有廣泛的抗菌活性，作為一種天然防腐劑，在食品工業(yè)中的應用廣泛。乳鏈球菌素的生物合成由nisABTCIPRKFEG基因簇完成(圖6)，基因簇包括編碼乳鏈球菌素前體(nisA)的結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄后修飾基因(nisB，nisC)、跨膜轉(zhuǎn)運基因(nisT)、切割前導序列的肽蛋白酶基因(nisP)、編碼免疫蛋白基因(nisI、nisF、nisE、nisG)和菌肽合成的調(diào)控基因(nisK、nisR)。

乳鏈球菌素的合成受雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)NisK和NisR的調(diào)控[48]。當組氨酸蛋白激酶NisK或應答調(diào)控蛋白NisR被破壞時，則不能合成乳鏈球菌素。乳鏈球菌素合成的群體感應調(diào)控過程如圖7所示。首先，在細胞中形成乳鏈球菌素前體，接著NisB和NisC修飾該前體，然后被NisP裂解后，由NisT轉(zhuǎn)運到細胞外。乳鏈球菌肽作為信號分子積累到一定閾值時被雙組分調(diào)控系統(tǒng)NisK、NisR識別，使細菌素合成基因表達。由于存在免疫蛋白，所以細菌本身不會被菌肽殺死或抑制。

圖7 乳鏈球菌素合成的群體感應調(diào)控過程[48]Fig.7 Regulation of Nisin synthesis by quorum sensing in LAB[48]

4 群體感應系統(tǒng)調(diào)控酸脅迫應答

對乳酸菌環(huán)境脅迫的研究主要是酸脅迫研究。Moslehi-Jenabian等[49]研究發(fā)現(xiàn)，逐漸適應酸脅迫環(huán)境的乳酸菌存活率高于那些直接暴露于酸環(huán)境的乳酸菌，適應酸脅迫環(huán)境的乳酸菌產(chǎn)生的信號分子AI-2的濃度低于直接暴露于酸環(huán)境的乳酸菌產(chǎn)生的濃度，同時，信號分子AI-2的分泌隨pH的降低而增加。鼠李糖乳桿菌GG和嗜酸乳桿菌NCFM中l(wèi)uxS基因的轉(zhuǎn)錄水平在酸性脅迫時間達1 h時顯著增加，并且不同菌株之間的轉(zhuǎn)錄水平存在差異，這可能是由于luxS基因參與了菌株的自我保護過程。Rorers等[50]發(fā)現(xiàn)在低劑量的青霉素刺激下，肺炎鏈球菌過表達luxS基因來自我保護。在鼠李糖乳桿菌GG的研究中發(fā)現(xiàn)，luxS基因突變的菌株耐酸性顯著降低，這也表明luxS基因在鼠李糖乳桿菌GG的酸脅迫適應過程中起重要作用。以上結(jié)果表明，由AI-2介導的QS系統(tǒng)可能參與了乳酸菌的酸脅迫應答反應。

5 總結(jié)與展望

群體感應系統(tǒng)是乳酸菌與環(huán)境相互作用的重要調(diào)控機制。近些年來，已經(jīng)廣泛開展了與乳酸菌基因組相關研究，例如用生物信息學的方法預測和分析已知乳酸菌的基因組，為在分子水平上系統(tǒng)地闡明乳酸菌的生理和代謝機制提供了可能。雖然已在保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和其他乳酸菌中發(fā)現(xiàn)了群體感應系統(tǒng)，但仍有許多問題有待進一步探索，例如：AI-2是否僅調(diào)控細菌本身的行為？它是否還參與與環(huán)境中其他細菌的交換？乳酸菌群體感應系統(tǒng)的深入研究有助于闡明乳酸菌適應環(huán)境以及益生功能的機制。