張?zhí)煺?，劉伶普，李文超，賈士儒，鐘 成

(天津科技大學 生物工程學院，天津 300457)

細菌生物膜是指細菌通過分泌細胞外聚合物(EPS)形成高度組織化、系統(tǒng)化的膜狀結構[1-2]。細菌可借助生物膜增強自身對于環(huán)境中多種脅迫、對抗生素的耐受性以及宿主免疫系統(tǒng)攻擊抵抗能力。雖然部分微生物生物膜的形成會導致食品腐敗變質、致病力增強、加劇耐藥形成等負面作用[3]，但功能性微生物生物膜具有廣闊的應用前景，如細菌纖維素(BC)。BC是一種三維網狀結構的胞外纖維素，具有高純度、高抗張強度、優(yōu)良的生物適應性等理化性質，在食品、醫(yī)療及材料領域廣泛使用[4-5]。目前，銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)[6]、大腸肝菌(E.coli)[7]、金黃色葡萄球菌(S.aureus)[8]與霍亂弧菌(V.cholerae)[9]等微生物的生物膜形成與群體感應現(xiàn)象間關聯(lián)已有部分研究。生物膜的形成過程與調控機制復雜，探究群體感應與生物膜之間的關系對降低細菌耐藥性、指導食品生產安全以及提高功能性生物膜產量具有現(xiàn)實意義。

1 群體感應系統(tǒng)

Nsalson等[10]在1970年報道了海洋費氏弧菌(Vibriofischeri)的菌體密度與一種夏威夷魷魚的生物發(fā)光能力成正相關，該現(xiàn)象受細菌的群體感應系統(tǒng)所調節(jié)。細菌在生長繁殖過程中會不斷生成1種自體誘導物(AI)的化學信號分子。它會隨著細菌的細胞種群密度不斷增加而同步增長[11]，當自體誘導物從細胞內擴散到細胞外，其在細胞外環(huán)境中累積達到一定閾值后開啟細胞密度依賴的特定基因表達，這種細菌細胞與細胞間的通訊系統(tǒng)即為群體感應(QS)。細菌主要的QS信號分子如表1所示，其調控的生理功能包括生物體的發(fā)光、Ti 質粒的接合與轉移、生物膜的形成與生長、細菌胞體的分化、抗生素的形成、胞外多糖的生成、病原微生物的毒性、細菌與生物體的共生等[12-15]。由于眾多人體或植物病原菌的病理反應受QS系統(tǒng)的調控，且許多微生物代謝產物也受到該機制的介導，QS系統(tǒng)已成為醫(yī)學、食品科學、生物工程學等多領域的研究熱點。

表1 細菌信號分子及作用Table 1 Structure and function of signal molecules in bacteria

1.1 革蘭氏陽性菌經典群體感應機制

在革蘭氏陽性菌的群體感應系統(tǒng)中，菌體內的前導肽被修飾和加工得到的寡肽類物質(AIPs)，即革蘭氏陽性菌的信號分子。AIPs類分子具有保守的內酯結構，由C端第5位的半胱氨酸與C末端的氨基酸殘基連接而成。與革蘭氏陰性菌的信號分子不同，AIPs不能自由地通過細胞膜，必須依賴膜上自誘導肽轉運系統(tǒng)或透性酶的協(xié)助。革蘭氏陽性菌的群體感應機制主要分為兩大系統(tǒng)：專一性的ATP-結合盒(ABC) 轉運系統(tǒng)[16]和調節(jié)信號轉導系統(tǒng)[17]。ABC轉運系統(tǒng)，負責信號分子的跨膜運輸；組氨酸蛋白激酶和天冬氨酸蛋白激酶作為兩組分調節(jié)系統(tǒng)(TCS)負責傳遞磷酸基團。細菌在生長繁殖過程中，大量AIPs被ABC系統(tǒng)轉運到細胞外，當AIPs含量到達特定閾值后，會被細胞膜上的雙組分受體特異性識別，激活受體激酶蛋白，使得組氨酸殘基磷酸化。隨后響應調節(jié)子蛋白活化，天冬氨酸殘基磷酸化。啟動子與活化的響應調節(jié)子結合，進而調控相關基因的表達。群體感應調控的目的基因中還包括部分自誘導肽修飾、ABC轉運與TCS系統(tǒng)基因，在一定的動態(tài)范圍內形成自誘導作用[18]。

1.2 革蘭氏陰性菌經典群體感應機制

1.2.1 費氏弧菌群體感應機制

QS系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)于由海洋費氏弧菌調控的夏威夷魷魚的發(fā)光現(xiàn)象中，當費氏弧菌的菌體密度達到一定的閾值后，就會誘導發(fā)光基因的表達。如圖1所示，費氏弧菌的QS系統(tǒng)由調控蛋白LuxR蛋白、自體誘導物合成酶LuxI蛋白和信號分子N-酰基高絲氨酸內酯類化合物(AHLs)三部分組成，被視為革蘭氏陰性菌群體感應的模式系統(tǒng)。許多革蘭氏陰性細菌的QS系統(tǒng)都與費氏弧菌中由LuxR/LuxI蛋白調控系統(tǒng)相似，如紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)[19]、銅綠假單胞菌[20-21]、根瘤菌(Rhizobium)[22]、木醋桿菌(Gluconacetobacterxylinum)[23]等。

圖1 群體感應系統(tǒng)LuxR/LuxI調節(jié)機制Fig.1 Regulatory mechanism of LuxR/LuxI in quorum sensing

AI合成酶LuxI蛋白能夠合成信號分子AHLs。LuxI蛋白酶通過將酰基-?；d體蛋白(acyl-ACP)的?；鶄孺溑cS-腺苷甲硫氨酸(SAM)的高半胱氨酸基團特異性結合，形成?；腍SL，隨后內酯化形成Acyl-HSL(AHLs)。LuxR家族蛋白是在信號分子AHLs介導的細菌QS中一類重要的轉錄調控蛋白，具有AI結合框，能夠與信號分子結合并參與細胞之間的感應。LuxR蛋白C端保守的螺旋-轉角-螺旋結構可以與目的基因轉錄調控區(qū)box序列特異性結合形成二聚體，調控特異基因表達。LuxR蛋白作為激活子與DNA作用會誘導RNA聚合酶與目的基因啟動子結合[24]。當AHLs濃度低于閾值時，N端序列會抑制C端序列與RNA聚合酶的結合；當AHLs濃度水平較高時，N端序列與AHLs結合，N端序列解除對C端序列的抑制，C-短端參與寡聚化并與啟動子DNA結合[25]。不同屬的微生物間的LuxR的氨基酸序列差異較大，但95%的LuxR型蛋白的AHL結合框結構處具有6個保守的氨基酸，分別是57位色氨酸(W57)、61位酪氨酸(Y61)、70位天冬氨酸(D70)、71位脯氨酸(P71)、85位色氨酸(W85)和113位甘氨酸(G113)[26]。不同細菌中LuxR蛋白具有特殊的AHLs?；Y合框，每一種細菌都能對其自身的群體感應信號識別、監(jiān)控、并作出反應。

毛磊磊等[27]對嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的研究發(fā)現(xiàn)：敲除luxR同源基因后，利用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)luxI基因的表達量顯著降低，表明敲除luxR同源基因會影響AHLs的合成酶基因表達量，從而抑制信號分子AHLs的生成。揭金鑫等[28]構建了luxR基因缺失海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)，發(fā)現(xiàn)缺失lusR缺失對菌體生長并無影響，而對其產硫能力影響顯著，削弱了該菌的致腐能力。Tang等[29]發(fā)現(xiàn)luxI和luxR缺失熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的生物膜和胞外多糖產量顯著降低，生物膜結構較薄且不致密，添加外源C4-HSL后，luxI缺失菌株的生物膜逐漸恢復致密。

不同AHLs分子的保守的疏水性的高絲氨酸內酯五元環(huán)部分高度保守，差異只在于親水性的酰胺側鏈的長度與結構[30]。酰胺側鏈的碳原子數從4個到18個不等，多為偶數個，奇數僅為7碳，并且鏈上的第3位碳原子上具有氫、羥基和羰基取代基[31]，圖2為一些典型的AHLs分子結構。當酰胺側鏈碳個數在8個以內時，AHLs可穿透磷脂雙層膜自由擴散，當側鏈大于10個碳則需借助于運輸載體來轉移[32]。

圖3 群體感應系統(tǒng)LasR/LasI和RhlR/RhlI的調節(jié)機制 Fig.3 Regulatory mechanism of LasR/LasI and RhlR/RhlI in quorum sensing

圖2 AHLs的基本結構Fig.2 Basic structure of AHLs

1.2.2 銅綠假單胞菌群體感應機制

銅綠假單胞菌的順序型QS系統(tǒng)由Las和Rhl系統(tǒng)組成，這些系統(tǒng)均受自誘導物AHLs調節(jié)[33]。如圖3所示，Las和Rhl系統(tǒng)分別由轉錄激活調控因子lasR、rhlR和自誘導物合成酶基因lasI、rhlI組成，它們負責檢測細胞的濃度，會隨著細菌種群數量變化對相應基因的表達做出調節(jié)。當LasR的自誘導物結合框和AHLs的同系物3-oxo-C12-HSL嵌合時，Las系統(tǒng)被激活并調控彈性蛋白酶、堿性蛋白酶、外毒素A等毒力因子的表達[34-36]。RhlR與AHLs另一同系物C4-HSL結合后可調控生成鼠李糖脂、幾丁質酶、氰化物等次級代謝產物。Las系統(tǒng)可以調控毒性基因的表達，Rhl系統(tǒng)也可以間接地通過調控Las系統(tǒng)來啟動毒性基因表達。Las系統(tǒng)不僅可以激活Rhl系統(tǒng)，還可通過LasI合成酶蛋白分泌產生的信號分子AHLs競爭性地抑制調控蛋白RhlR與其自身信號分子的結合，起到相應的負調控作用[37]。

2 群體感應系統(tǒng)對生物膜生成的調控作用

2.1 群體感應系統(tǒng)直接介導生物膜形成

細菌生物膜的形成過程主要分為四大階段，如圖4所示。最初為細菌初始聚集階段，細菌借助鞭毛的運動、流體動力、布朗運動等方式到達載體表面；第二階段為細胞間的黏附和增殖過程，吸附到載體表面的細菌在繁殖過程中通過調節(jié)基因表達，分泌出EPS(包括多糖、蛋白質、胞外DNA等)黏附于載體表面形成聚集態(tài)；第三階段為生物膜成熟，細菌通過生長和繁殖形成復雜的三維結構的生物膜；第四階段為生物膜的分散，生物膜中的EPS分解，單個細菌脫離生物膜，進入周圍環(huán)境中，進入下一個生物膜周期。QS系統(tǒng)通過監(jiān)測其群體的細胞密度來調節(jié)特定的基因表達，控制整個細菌群體的生長、代謝等行為，以確保生物膜中微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)與代謝物的正常分泌，避免營養(yǎng)物質缺乏等，為菌體生長以及生物膜形成提供保障[38]。

QS系統(tǒng)和環(huán)境信號應答系統(tǒng)調控細菌形成成熟的生物膜，主要是通過細菌生長過程中不利的環(huán)境因子誘發(fā)細胞的環(huán)境信號應答系統(tǒng)，使細菌分泌信號分子，當其累積達到一定閾值時，就會結合到細菌的信號分子應答元件上，改變細胞內的調控元件轉錄或表達，從而調控EPS(多糖基質、脂質蛋白、纖維蛋白等)的合成控制細菌的粘附能力，影響生物膜成熟與結構[39-40]。QS系統(tǒng)還可促進生物膜的解離過程，金黃色葡萄球菌的Agr系統(tǒng)可通過上調多肽酶和核酸酶的表達促進生物膜解離，加速細菌分散、感染[41-42]。

圖4 群體感應系統(tǒng)在細菌生物膜形成中的調控過程Fig.4 The control process of Quorum sensing in bacterialbiofilm

另一方面，QS系統(tǒng)介導EPS分泌還可使生物膜從延展模式切換為保護模式，利用EPS應對環(huán)境威脅[43]。QS調節(jié)系統(tǒng)表明細菌間的信息交流是一種動態(tài)的過程，受到了營養(yǎng)成分、溫度、pH等多種環(huán)境因子的影響，是一個復雜的動態(tài)過程。Kim等[44]發(fā)現(xiàn)假單胞菌產生的鼠李糖脂，可促進細菌從生物膜中分離來影響生物膜形成，之后鼠李糖脂作為生物表面活性劑被廣泛應用于抗菌、防污染等方面[45]。Davies等[46]對銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)與生物膜關系的研究中發(fā)現(xiàn)，不能產生特定AHLs信號分子的突變菌株只能形成均質、扁平的生物膜；在人為添加信號分子后，突變菌株又能形成成熟的生物膜，從而證實QS系統(tǒng)可調控銅綠假單胞桿菌生物膜的形成與結構。Hebert等[47]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌(Escherichiacoli)可通過SdiA蛋白檢測其他細菌分泌的AHLs，來控制細胞膜的合成。

2.2 群體感應系統(tǒng)協(xié)同其他信號分子介導生物膜形成

除了基于群體感應系統(tǒng)調控外，部分細菌中還存在著同樣可介導生物膜形成的其他信號分子，在生物膜形成階段中有著重要作用。環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)是一種對纖維素合成酶有變構激活作用的鳥苷酰寡核苷酸類物質，為第二信使分子之一[48]。其濃度受自體誘導物的調節(jié)，它可以快速升降來調節(jié)細胞內代謝系統(tǒng)的酶活性，控制營養(yǎng)成分的吸收利用、能量轉移、細胞代謝物分泌等微生物生命活動。第二信使也控制著細胞的增殖、分化和生存，并參與基因轉錄的調控[49-50]。c-di-GMP的合成酶和降解酶感受胞外信號后可改變胞內c-di-GMP水平，進而在轉錄、翻譯和翻譯后水平上調控細菌生物被膜形成、EPS分泌、毒性因子產生、細胞運動、黏附性等生理功能。

c-di-GMP調控的細胞運動、EPS分泌、生物膜形成等功能同時受控于群體感應系統(tǒng)，Waters等[51]發(fā)現(xiàn)在霍亂弧菌中當存在QS調節(jié)子HapR時，QS系統(tǒng)對生物膜的調節(jié)作用依賴于c-di-GMP。Rahman等[52]報道了維羅納氣單菌(Aeromonasveronii)中c-di-GMP的增加可以促進C4-HSL信號分子的產生。Bomin等[53]報道了銅綠假單胞菌QS中LasR/LasI系統(tǒng)可通過誘導DGC活性來正向調控c-di-GMP，RhlR/RhlI系統(tǒng)通過誘導PDE活性來負向調節(jié)c-di-GMP水平，QS系統(tǒng)與c-di-GMP相互交叉調控細胞毒力與生物膜形成。Theodora等[54]發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌的QS系統(tǒng)中HapR蛋白可抑制c-di-GMP合成基因的表達，通過促進c-di-GMP降解而間接抑制生物膜的形成，由于HapR的合成存在時間性，因此這種抑制作用僅存在于高細胞密度時；而低細胞密度時，c-di-GMP的合成未受到抑制，其濃度增加，可促進霍亂弧菌的多糖合成，進而促進生物膜的形成，這一發(fā)現(xiàn)同時證明了在QS信號分子未達到閾值時，c-di-GMP調控著細菌的運動聚集、增殖、營養(yǎng)吸收、合成EPS等生理功能，隨著細胞密度增高并到達閾值，QS系統(tǒng)開始調控生物膜黏附、成熟與分散過程，進而印證了c-di-GMP的信號通路并不是孤立的，而是與雙組分系統(tǒng)、QS系統(tǒng)等組成了復雜的信號傳遞網絡，共同介導細菌生物膜的形成。

3 結論

微生物中細胞與細胞之間的交流是一種極其普遍的現(xiàn)象，不同細菌的QS機制與其調控的生理功能各具特色，可在不同的工業(yè)領域中加以應用。例如通過分子手段抑制信號分子的生成、信號分子降解酶制劑、針對自誘導物結合域尋找信號分子類似物競爭抑制等方式抑制致病菌生物膜的形成，為解決食品安全、醫(yī)療健康問題提供新思路。而有益微生物生物膜的形成有利于抵抗環(huán)境脅迫壓力，同時功能性生物膜也具有良好的應用前景及研究意義。隨著對群體感應系統(tǒng)復雜性的重視程度的加深，對信號的生物分子合成及調控機制的研究顯得尤為重要，深入探究其介導生物膜形成機制，為研究細菌群體感應系統(tǒng)拓寬思路。