張 雪， 李 萍， 李鈺穎， 馬科哲， 宋厚輝， 金慶日

(浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

多西環(huán)素為四環(huán)素類(lèi)半合成衍生物廣譜抗生素，在堿性、強(qiáng)酸性環(huán)境下均不穩(wěn)定，多西環(huán)素常以鹽酸鹽的形式制備，稱(chēng)鹽酸多西環(huán)素(Doxycycline Hydrate)。多西環(huán)素主要作用位點(diǎn)是核糖體，通過(guò)與細(xì)菌核糖體 3S小亞基結(jié)合，干擾氨基酰 tRNA與30S小亞基結(jié)合，使氨基酰 tRNA不能進(jìn)入 mRNA上的受位，從而抑制蛋白質(zhì)合成時(shí)肽鏈的延長(zhǎng)，使蛋白質(zhì)合成受阻[1]。多西環(huán)素與天然四環(huán)素類(lèi)藥物(如土霉素、四環(huán)素)相比，多西環(huán)素具有抗菌活性和組織穿透力更強(qiáng)[2-3]、體內(nèi)分布廣[4-5]、生物利用度高、半衰期較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[6-7]。在目前的臨床應(yīng)用中，普通鹽酸多西環(huán)素制劑一般很難克服鹽酸多西環(huán)素本身具有的幾個(gè)突出缺陷，如易絡(luò)合、不穩(wěn)定、易耐藥、低含量、性價(jià)比低等。浙江萬(wàn)方生物科技有限公司研制的50%鹽酸多西環(huán)素絡(luò)合制劑(以下簡(jiǎn)稱(chēng)絡(luò)合制劑)，成功克服了鹽酸多西環(huán)素易與金屬離子絡(luò)合、水溶液中不穩(wěn)定及耐藥性等問(wèn)題。相比普通的10%鹽酸多四環(huán)素，絡(luò)合制劑的多西環(huán)素含量大幅提高，絡(luò)合制劑更加高效，臨床使用相對(duì)量減少，價(jià)格優(yōu)勢(shì)明顯，在臨床應(yīng)用中可實(shí)現(xiàn)低投入，高效果。但尚未有關(guān)于絡(luò)合制劑在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或靶動(dòng)物上進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)的報(bào)道。因此，該試驗(yàn)將用常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠進(jìn)行多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑的藥物代謝動(dòng)力學(xué)(藥動(dòng)學(xué))試驗(yàn)，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，闡明多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律，為其臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。該研究的順利進(jìn)行將塑造良好的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境，有利于鹽酸多西環(huán)素藥價(jià)市場(chǎng)化機(jī)制的形成，以供臨床應(yīng)用，迎合養(yǎng)殖市場(chǎng)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1) 儀器 電子分析天平(BSA124S，上海錫為科學(xué)儀器有限公司)、高速離心機(jī)(Eppendorf centrifuge 5418，廣州雷得生物技術(shù)有限公司)、磁力攪拌器(85-2，杭州儀表電機(jī)有限公司)、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS，美國(guó)沃特世公司)、Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18 色譜柱(美國(guó)沃特世公司)、振蕩混勻器(Vortexgenie2，妙生科技有限公司)、真空濃縮儀(德國(guó)艾本德公司)、超聲波清洗器(Biosafer SB-5200DT，南京賽飛生物科技有限公司)。

2) 試驗(yàn)動(dòng)物 健康、體重相似的SPF大鼠6只，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

3) 試劑 鹽酸多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑由浙江惠嘉生物科技股份有限公司提供。肝素鈉(Heparin sodium salt, 185 USP units/mg)、生理鹽水、乙腈、甲酸、三氯乙酸購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，舒泰50購(gòu)自法國(guó)維克公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

1) 流動(dòng)相的制備

0.1%甲酸(A)∶乙腈(B) = 95∶5 (V/V)

2) 多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取多西環(huán)素100 mg，置于5 mL容量瓶，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成濃度為20 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。用流動(dòng)相進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)@得濃度為100、250、5 000、1 000、2 500、5 000、10 000、20 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2 灌服給藥

健康大鼠6只，在溫度和濕度恒定的試驗(yàn)動(dòng)物房(浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院)適應(yīng)飼養(yǎng) 1周后，隨機(jī)分為原粉組和制劑組。灌服給藥前禁食12 h以上，不禁水。以25 mg/kg劑量，給其中3只灌服多西環(huán)素原粉溶液，另外3只灌服絡(luò)合制劑溶液。大鼠的體重為(283±6) g。

1.2.3 給藥和采血方案

大鼠施行股靜脈和股動(dòng)脈手術(shù)。原粉組和制劑組以25 mg/kg劑量灌服原粉和絡(luò)合制劑。分別在大鼠灌服給藥后0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10 h，通過(guò)股動(dòng)脈采集血液，每次采集0.22 mL血液并通過(guò)股靜脈補(bǔ)充相應(yīng)體積的生理鹽水。將采集好的全血置于肝素納離心管中，以8 000 r/min 離心3 min，取血漿并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的預(yù)處理

取45 μL大鼠空白血漿，置于1.5 mL離心管中，每管加5 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液(終濃度分別為10、25、50、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL)，渦旋振蕩混勻，13 000 r/min離心10 min，加200 μL三氯乙酸(1 mol/L)，渦旋震蕩10 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清200 μL至樣品瓶，用UPLC/MS/MS檢測(cè)。以多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度為橫坐標(biāo)，多西環(huán)素的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 血液樣品預(yù)處理與檢測(cè)

取50 μL大鼠血漿樣品，置于1.5 mL離心管中，加200 μL三氯乙酸(1 mol/L)，渦旋震蕩10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清200 μL至樣品瓶，用UPLC/MS/MS檢測(cè)。

1.2.6 液相色譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18 Column(2.1×100 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相0.1%甲酸(A)∶乙腈(B) = 95∶5 (V/V)。梯度洗脫條件：0～2 min為90% A，3～4 min為30% A，5～6 min為90% A。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，分析時(shí)長(zhǎng)9 min。

1.2.7 質(zhì)譜分析條件

用電噴霧離子源(ESI)，正離子(ES+)模式進(jìn)行掃描，多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下進(jìn)行檢測(cè)。多西環(huán)素母離子的質(zhì)荷比(m/z)為445.2，二級(jí)質(zhì)譜子離子的質(zhì)荷比為428.2和108.2，相應(yīng)的碰撞電壓分別為25和20 eV[8]。其他參數(shù)的設(shè)置如下：脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/hr，錐孔電壓25 V，錐孔氣流量50 L/hr，毛細(xì)管電壓3.50 kV。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

用 Winnonlin 軟件的非房室模型，計(jì)算各種藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，如消除半衰期(t1/2)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、達(dá)峰濃度(Cmax)、藥-時(shí)曲線下面積(AUC)、表觀分布容積(Vz)、體清除率(CL)和平均滯留時(shí)間(MRTlast)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜分析

由圖1可知，在正離子模式下，母離子經(jīng)能量碰撞，碎裂成2個(gè)特征性子離子。質(zhì)荷比為445.2的多西環(huán)素母離子碎裂成質(zhì)荷比為428.2和108.2的子離子。

圖1 在正離子模式下獲得的多西環(huán)素二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2 多西環(huán)素血漿樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度依次為10、25、50、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL。以多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液的終濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=326 X+15 019，R2=0.992 8。

為檢測(cè)UPLC/MS/MS分析方法的特異性，檢測(cè)了大鼠空白血漿、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品(500 ng/mL)和大鼠灌服絡(luò)合制劑后1.5 h的血漿樣品(圖3a～c)。如圖3a所示，大鼠空白血漿樣品中沒(méi)有明顯的雜質(zhì)峰，因此，此分析方法可應(yīng)用于多西環(huán)素大鼠血漿樣品的分析。如圖3b,c所示，多西環(huán)素的保留時(shí)間為4.05 min，峰型對(duì)稱(chēng)，分離度好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

圖2 多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 大鼠灌服多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑溶液后的血藥濃度

a為大鼠空白血漿色譜圖；b為多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液(500 ng·mL-1)色譜圖；c為大鼠灌服絡(luò)合制劑后1.5 h的色譜圖

圖3 色譜圖

Fig.3 Chromatogram

表1 灌服鹽酸多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑后的血藥濃度

圖4為大鼠灌服多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑后的藥-時(shí)曲線。由表1和圖4可知，除了給藥后初始階段(0.083～0.25 h)以外，大鼠灌服絡(luò)合制劑后的血藥濃度均高于多西環(huán)素原粉的血藥濃度。其中，大鼠灌服絡(luò)合制劑后2 h的血藥濃度顯著高于多西環(huán)素原粉(表1)。如圖4和表2所示，絡(luò)合制劑的AUCall和AUCinf均大于多西環(huán)素原粉的AUCall和AUCinf，表明絡(luò)合制劑在大鼠體內(nèi)到達(dá)全身血液循環(huán)的量大于多西環(huán)素原粉。

圖4 大鼠灌服多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑后的藥-時(shí)曲線

2.4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算

用Winnonlin軟件中非房室模型，計(jì)算各種藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，表2為大鼠灌服多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。其中，AUCall指t0到t10 h的藥時(shí)曲線下面積， AUCINF指t0-t∞的藥時(shí)曲線下面積，MRTlast為平均滯留時(shí)間。

注:***P<0.001。

由表2可知，大鼠灌服絡(luò)合制劑后的Tmax和Cmax均大于多西環(huán)素原粉，AUCall和AUCinf也均大于多西環(huán)素原粉的AUCall和AUCinf。大鼠灌服絡(luò)合制劑和原粉后的Vz無(wú)顯著性差異。絡(luò)合制劑的t1/2和MRTlast均小于多西環(huán)素原粉，表明絡(luò)合制劑在體內(nèi)的滯留時(shí)間短于多西環(huán)素原粉，因此，可判定絡(luò)合制劑可縮短休藥期。

3 討論與結(jié)論

血漿、血清、尿液等生物樣品在分析過(guò)程中，易發(fā)生待分析物質(zhì)的損失和信號(hào)波動(dòng)，尤其在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，樣品中的內(nèi)、外源性物質(zhì)會(huì)影響分析物的離子化，使質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度降低或增加，即產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。血漿樣品中的磷脂、蛋白以及鹽類(lèi)屬于內(nèi)源性物質(zhì)，其中磷脂對(duì)質(zhì)譜結(jié)果影響最大，可在較大程度上抑制質(zhì)譜響應(yīng)且難以去除[9]。蛋白沉淀( Protein precipitation, PPT )是較簡(jiǎn)單快速的方法，常用的試劑包括有機(jī)溶劑、酸、鹽和金屬離子。有機(jī)溶劑是應(yīng)用最廣泛的蛋白沉淀劑，它能降低介電常數(shù)，促進(jìn)蛋白間的靜電作用，導(dǎo)致蛋白聚沉[10]。研究表明，常用的有機(jī)溶劑中，乙腈的沉淀效果最佳，與血漿比例為4∶1時(shí)，蛋白沉淀率可高達(dá)98.5 %，且種屬間無(wú)明顯差異[11]。如果分析物是可電離的，流動(dòng)相的pH值會(huì)對(duì)分離物的保留度、選擇性和靈敏度產(chǎn)生顯著影響[9]。傳統(tǒng)的蛋白沉淀-離心技術(shù)簡(jiǎn)單易操作、成本低，但需要人工標(biāo)記離心管、提取上清，存在操作耗時(shí)、難以實(shí)現(xiàn)高通量等缺點(diǎn)[12]。有研究指出，使用乙腈沉淀蛋白時(shí)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的離子抑制作用，影響質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度[9]。除此法之外，還有其他處理技術(shù)，能有效減少藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)中血漿樣品的處理時(shí)間[13]。該試驗(yàn)用蛋白沉淀法進(jìn)行大鼠血漿樣品的預(yù)處理。

Tmax是達(dá)峰時(shí)間，指達(dá)到峰濃度所需時(shí)間。Cmax是達(dá)峰濃度，指給藥后達(dá)到的最高血藥濃度。Tmax和Cmax均與灌服給藥后藥物在體內(nèi)的吸收快慢和速率有關(guān)。AUC是藥時(shí)曲線下面積，反映到達(dá)全身血液循環(huán)的藥物總量。大鼠灌服絡(luò)合制劑后的Tmax和Cmax均大于多西環(huán)素原粉，AUCall和AUCinf也均大于多西環(huán)素原粉的AUCall和AUCinf，表明絡(luò)合制劑在大鼠體內(nèi)的吸收速率和吸收程度均大于鹽酸多西環(huán)素原粉，由此可以推測(cè)絡(luò)合制劑在大鼠體內(nèi)的生物利用度也高于鹽酸多西環(huán)素原粉。

大鼠灌服鹽酸多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑后，均出現(xiàn)了“雙峰現(xiàn)象”(圖4)。這與多西環(huán)素在體內(nèi)進(jìn)入肝腸循環(huán)有關(guān)。經(jīng)膽汁排泄到小腸的多西環(huán)素，再一次經(jīng)過(guò)小腸和大腸時(shí)，又被重吸收，進(jìn)入到血液循環(huán)，使多西環(huán)素的血藥濃度升高，導(dǎo)致“雙峰現(xiàn)象”[14-16]。

該試驗(yàn)用UPLC/MS/MS檢測(cè)大鼠血漿中多西環(huán)素的濃度，通過(guò)藥動(dòng)學(xué)研究闡明鹽酸多西環(huán)素原粉和絡(luò)合制劑在大鼠體內(nèi)的ADME過(guò)程。試驗(yàn)結(jié)果表明，絡(luò)合制劑比原粉具有更高的吸收和更短的滯留時(shí)間，臨床應(yīng)用可適當(dāng)減少給藥劑量或增加給藥間隔時(shí)間，也可縮短休藥期。該試驗(yàn)的研究結(jié)果將為絡(luò)合制劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，也將為同類(lèi)藥物的藥動(dòng)學(xué)研究提供參考。