閆非凡， 李 楠， 呂 云， 陳 迪， 樸仁哲, 趙洪顏*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002;2. 琿春市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，吉林 琿春 133300)

地球表面大約75%處于低溫環(huán)境[1]。在低溫環(huán)境中微生物資源非常豐富，這些微生物資源發(fā)揮著重要的作用，其中厭氧消化過程是碳源降解重要的一環(huán)[2]。產(chǎn)甲烷菌在厭氧消化過程中只占微生物種群的10%左右，但卻是關(guān)鍵菌群，因?yàn)橛善渫瓿傻漠a(chǎn)甲烷過程通常是厭氧消化過程中最重要的限速步驟。因此，挖掘低溫厭氧消化過程對(duì)菌種資源發(fā)揮著舉足輕重的作用。

國外對(duì)低溫產(chǎn)甲烷菌研究較早，自從1992年第1株從湖泊底泥中分離得到嗜冷產(chǎn)甲烷菌Methanococcoidesburtonii后已經(jīng)獲得了8個(gè)低溫產(chǎn)甲烷菌種，但是多集中在產(chǎn)甲烷八疊球菌，產(chǎn)甲烷鬃毛菌等[3]；國內(nèi)對(duì)低溫產(chǎn)甲烷菌的研究剛剛起步，東秀珠等人從若爾蓋草原分離獲得了1株低溫甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌新種并命名為Methanolobuspsychrophilus[4]，灑威等人在中低溫沼氣池中分離一株低溫產(chǎn)甲烷菌，但是未對(duì)菌株進(jìn)行鑒定[5]；魯建江等人在越冬的沼氣池中分離得到1株低溫產(chǎn)甲烷八疊球菌[6]；李軍等人在實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期運(yùn)行的UASB反應(yīng)器中分離得到1株產(chǎn)甲烷粒菌屬[7]。而對(duì)低溫下的產(chǎn)甲烷微菌的分離研究較少，但前期研究證實(shí)低溫厭氧消化產(chǎn)甲烷階段產(chǎn)甲烷微菌對(duì)菌群的代謝流程起著至關(guān)重要的作用[8]。

因此，該研究在延邊地區(qū)濕地環(huán)境中低溫下采集樣品，采用亨蓋特厭氧技術(shù)、16S rDNA基因測(cè)序技術(shù)、掃描電鏡等技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行分離與系統(tǒng)發(fā)育分析，期待為低溫厭氧消化過程中產(chǎn)甲烷微菌對(duì)沼氣發(fā)酵的代謝機(jī)制和調(diào)控技術(shù)研究提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

污泥樣品采自延邊地區(qū)的敦化雁鳴湖濕地(敦化5和40 cm的污泥(DH5、DH40)、琿春濕地5、25、40 cm(HC5、HC25、HC40)的污泥樣品，樣品放在-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

富集培養(yǎng)基配制方法為：培養(yǎng)基具體成分和含量見表1，2。調(diào)節(jié)pH值為6.8～7.0。用無菌注射器接菌，接種量為10%(V/V)。接種后補(bǔ)加混合氣體，搖勻后用熔蠟消毒器熔蠟封口，置于15 ℃低溫培養(yǎng)箱富集培養(yǎng)[4]。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)甲烷微菌的富集培養(yǎng)及分離純化

樣品的富集培養(yǎng)和分離純化使用上海躍進(jìn)YQX-1型厭氧培養(yǎng)箱。培養(yǎng)的氣體為N2∶H2∶CO2=85%∶10%∶5%和99.999%的高純N2，氣瓶減壓閥輸出壓力為0～0.25 MPa，粑粒除氧催化劑和干燥劑除氧。采集的污泥樣品，加入到產(chǎn)甲烷微菌的專用培養(yǎng)基中15 ℃低溫培養(yǎng)7 d，第1次富集接種量為10%，取菌液第2次富集，接種量為10%，按照同樣方法多次富集，通過甲烷含量指標(biāo)監(jiān)測(cè)富集情況。采用Hungate滾管法進(jìn)行分離純化[6]。

表1 產(chǎn)甲烷菌的富集、分離培養(yǎng)基

1.2.2 低溫產(chǎn)甲烷微菌菌株篩選

純化后的產(chǎn)甲烷微菌，將產(chǎn)甲烷微菌株接種到pH值為7.0，產(chǎn)甲烷液體培養(yǎng)基中，在5、10、15、20、30 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，利用氣相色譜測(cè)定甲烷含量，通過產(chǎn)氣情況篩選菌株。

1.2.3 菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗(yàn)

1) 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定：用紫外可見分光光度計(jì)(UV-7502PC)在波長(zhǎng)600 nm測(cè)定菌液的吸光度OD600。

2) 菌體形態(tài)學(xué)觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期樣品，革蘭氏染色后采用Olympus體式顯微鏡觀察菌株的菌落形態(tài)；采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的樣品，干燥、固定后采用掃描電鏡HITACHI S-4800觀察并拍照。

3) 最適溫度、pH值、NaCl濃度生長(zhǎng)試驗(yàn)：在液體培養(yǎng)基中添加5%的菌株，厭氧培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)10 d，氣相色譜測(cè)定甲烷產(chǎn)量。

4) 生長(zhǎng)底物測(cè)定：甲醇、甲酸、H2/CO2(80∶20)為單一碳源，加入到滅菌后的產(chǎn)甲烷微菌培養(yǎng)基中，pH值7.0，培養(yǎng)溫度15 ℃，培養(yǎng)10 d測(cè)定產(chǎn)甲烷含量[9]。

1.2.4 產(chǎn)甲烷菌16S rRNA基因的擴(kuò)增、測(cè)序鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

DNA的提取參照趙洪顏等的方法[10]。16S rRNA基因的擴(kuò)增選用上海生工股份有限公司用HAP法合成的引物：引物Arch519F的序列為5’-CAGCCGCCGCGGTAA-3’，引物Arch915R的序列為5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’。PCR方法參照[11]。經(jīng)上海生工測(cè)序公司測(cè)定后，將16 S rRNA基因的測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)分析，用Mega 6進(jìn)行bootstrap分析，重復(fù)1 000次，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 產(chǎn)甲烷菌富集、分離培養(yǎng)基中的微量元素和維生素溶液

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)甲烷微菌的富集培養(yǎng)及篩選

圖1為富集培養(yǎng)轉(zhuǎn)接第7代菌液1～10 d的OD600值。由圖可知，富集菌液的OD600都在6 d達(dá)到最大值，之后稍有降低，敦化40 cm的富集菌液在6 d的OD600最大，說明DH40的產(chǎn)甲烷菌在所有富集菌液樣品中生長(zhǎng)能力最強(qiáng)。并且可以看出，通過對(duì)各樣品7代的富集轉(zhuǎn)接，菌種得到馴化，適應(yīng)該試驗(yàn)所設(shè)的培養(yǎng)溫度和其他條件，可以進(jìn)行下一步的分離試驗(yàn)。此外，HC5、HC25、HC40、DH5、DH40的OD600值分別為0.67、0.636、0.605、0.655和0.651，菌液的OD600值均處在0.6～0.8之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。說明當(dāng)產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)至10 d時(shí)，培養(yǎng)基中菌群的生長(zhǎng)繁殖已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，可以進(jìn)行下一代富集培養(yǎng)。

圖1 產(chǎn)甲烷菌富集菌液的OD600值

2.2 產(chǎn)甲烷微菌的分離純化及生理生化特征

顯微鏡下觀察和掃描電鏡照片見圖2，3。由圖可知，15 ℃下培養(yǎng)10 d長(zhǎng)出的菌落為圓形，規(guī)則，邊緣完整，表面光滑，不透明，呈現(xiàn)乳白色，直徑約0.6 μm，長(zhǎng)1.5～2 μm，革蘭氏染色為陰性，極端嚴(yán)格厭氧，桿狀。

圖2 菌落形態(tài)和革蘭氏染色照片 圖3 產(chǎn)甲烷微菌分離菌株掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 Colony morphology and gram staining Fig.3 Scanning electron micrograph of isolated methanogen strain

BDP-8菌株在pH值為4～9時(shí)均能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)最適pH值為7；BDP-8菌株在5～30 ℃均能生長(zhǎng)，最適溫度為15 ℃；BDP-8菌株在0～0.6 mol/L NaCl濃度下均能生長(zhǎng)，而高于0.6 mol/L NaCl濃度時(shí)，產(chǎn)甲烷停止，說明最適NaCl濃度為0～0.4 mol/L(圖4)。底物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BDP-8菌株接種碳源底物后，只能利用H2/CO2(80:20) 混合氣體，不能利用甲醇、甲酸(表3)。BDP-8菌株生理生化特征(表3)，BDP-8菌株的最適生長(zhǎng)溫度、pH值、NaCl濃度、生長(zhǎng)底物等與目前已報(bào)道的產(chǎn)甲烷微菌株非常相似；系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了此結(jié)果。

圖4 不同pH值、溫度、NaCl濃度下甲烷含量

表3 BDP-8菌株與其它產(chǎn)甲烷微菌屬菌株主要生理生化特征比較

2.3 菌株16S rDNA基因測(cè)序鑒定

從富集菌液中分離出1株產(chǎn)甲烷菌命名為BDP-8，圖5為BDP-8菌株16S rRNA gene的同源性結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹，BDP-8菌株與Methanolacinia屬的3個(gè)菌株16S rDNA基因序列相似性為100%，通過NCBI上BLAST BDP-8菌株可為Methanolaciniapetroleariastrain，屬于Methanomicrobia；Methanomicrobiales；Methanomicrobiaceae；Methanolacinia。

注：BDP-8為分離菌株的編號(hào)；屬種前的序號(hào)為GenBank登錄號(hào)；分支節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字代表在1 000次構(gòu)樹過程中的自展值；標(biāo)尺代表序列差異度為1%

圖5 BDP-8菌株16S rDNA gene的系統(tǒng)發(fā)育分析

Fig.5 16S rDNA gene phylogenetic analysis of BDP-8 strain

3 討論與結(jié)論

利用厭氧消化技術(shù)不僅可以處理廢棄物資源而且還可以生產(chǎn)清潔能源，是一項(xiàng)一舉雙得的技術(shù)，但是在寒冷地區(qū)受溫度的影響無法大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化，主要原因是低溫限制了產(chǎn)甲烷微生物的代謝，影響了產(chǎn)甲烷菌的活性，所以，如何挖掘低溫下的微生物資源，從本質(zhì)上提高產(chǎn)甲烷菌的活性至關(guān)重要。因此，該試驗(yàn)從延邊地區(qū)低溫生境中篩選到優(yōu)良的微生物菌株，對(duì)于解析低溫下沼氣發(fā)酵的代謝途徑及提高沼氣發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷效能具有重要意義。在延邊地區(qū)敦化、琿春不同深度的湖底底泥中分離出1株BDP-8菌株，此菌株生長(zhǎng)能力最強(qiáng)，低溫的耐受性最好；該菌株最適合的生長(zhǎng)溫度為15 ℃、pH值為7.0、NaCl濃度為0～0.4 mol/L; 該菌株只能利用H2/CO2(80∶20) 混合氣體。16S rDNA gene的系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為產(chǎn)甲烷微菌。