馬禮鴻，高 靜，王 凱，李婷燕，劉曉麗

非小細(xì)胞肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其浸潤、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤本質(zhì)上是一種基因病，腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素參與的復(fù)雜多變的生物學(xué)過程。細(xì)胞外基質(zhì)與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，TNC作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分是一種大分子量細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，有研究表明，TNC可表達(dá)于人類多種惡性腫瘤中，且對腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移具有一定的抑制效應(yīng)[1]。腫瘤標(biāo)志基因USP22主要是通過對底物靶分子去泛素化修飾發(fā)揮重要功能，在腫瘤進展過程中可能起關(guān)鍵作用[2]。Ki-67是單克隆抗體Ki-67的抗原標(biāo)志物，同時也是現(xiàn)階段最被認(rèn)可的腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物，其蛋白表達(dá)水平和腫瘤惡性程度有關(guān)，可作為腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷的依據(jù)[3]。本組前期實驗提示[4]，XIAP表達(dá)增高可能與腫瘤高度浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)，XIAP高表達(dá)可能使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞逃避凋亡機制和生長監(jiān)控異常增殖，促進非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展。本實驗將在前期實驗的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR和免疫組化法聯(lián)合檢測非小細(xì)胞肺癌組織中TNC、USP22、Ki-67基因的表達(dá)水平，初步探討非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移機制，為其臨床治療及預(yù)后判斷提供重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2017年5月～2018年10月遵義醫(yī)學(xué)院及遵義市第一人民醫(yī)院病理科存檔的手術(shù)切除的新鮮非小細(xì)胞肺癌組織46例，每份標(biāo)本留取癌組織和癌旁正常組織，離體后一部分組織快速加入總RNA提取試劑TRIZOL進行后續(xù)RT-PCR檢測，另一部分組織加入10%中性福爾馬林固定進行后續(xù)免疫組化試驗。其中腺癌26例，鱗狀細(xì)胞癌20例。男性24例，女性22例；年齡<45歲21例，≥45歲25例；腫瘤直徑≤2 cm者18例，>2 cm 28例。按WHO標(biāo)準(zhǔn)，組織學(xué)分級：高分化19例，中分化10例，低分化17例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期23例，Ⅲ+Ⅳ期23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。

1.2 主要試劑 一抗兔抗人TNC、USP22、Ki-67均購自Abcam公司；SP免疫組化染色試劑購于北京中杉金橋公司；細(xì)胞總RNA提取試劑TRIZOL、c-DNA合成試劑盒和2×taq PCR Master Mix均購自北京天根生物公司。

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用SP法，實驗操作步驟嚴(yán)格按說明書進行，用陽性非小細(xì)胞肺癌切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。TNC蛋白結(jié)果判定：隨機選取5個高倍鏡視野，無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞占1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度：細(xì)胞外基質(zhì)中TNC無表達(dá)為0分，局部斷線狀表達(dá)為1分，連線狀表達(dá)為2分，大量網(wǎng)格狀表達(dá)為3分。將上述兩項得分結(jié)果相加：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性()，>4分為強陽性()。統(tǒng)計學(xué)處理時將≥1分歸為陽性，記為“+”。USP22蛋白和Ki-67蛋白結(jié)果判定：200倍鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞占鏡下細(xì)胞的百分比：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，10%～25%為(+)，26%～50%為()，>50%為()。統(tǒng)計學(xué)處理時將陽性細(xì)胞數(shù)≥10%歸為陽性，記為“+”。

1.4 RT-PCR 按照TRIZOL試劑說明書提取TNC、USP22、Ki-67在非小細(xì)胞肺癌組織中的總RNA。TNC引物序列：上游5′-CTGTCACCGTGTCAACCTGA-3′，下游5′-TATCCCAA CATTCCCCGCTT-3′；USP22引物序列：上游5′-CCATCTTT GTCCGGCCTCC-3′，下游5′-CCAACGCCTTGCATTTTC CA-3′；Ki-67引物序列：上游5′-CTTTGGGTGCGACTTGAC GA-3′，下游5′-TTCTGCCATTACGTCCAGCG-3′；β-actin引物序列：上游5′-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，下游5′- GTGATCTC CTTCTGCATCCTGT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性25 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33次循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。使用2.0%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間的差異采用χ2檢驗，采用Spearman秩相關(guān)性比較，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNC、USP22及Ki-67蛋白在正常肺組織和非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá) TNC蛋白主要表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌巢周圍細(xì)胞外基質(zhì)、基膜，呈細(xì)條狀棕黃色或棕褐色區(qū)(圖1A、B)，在肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率分別為73.07%(19/26)和75.00%(15/20)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。USP22蛋白主要表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1C、D)，在肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率分別為69.23%(18/26)和70.00%(14/20)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。Ki-67蛋白主要表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞胞核，部分細(xì)胞胞質(zhì)也呈陽性反應(yīng)并呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1E、F)，在肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率分別為61.53%(16/26)和75.00%(15/20)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.2 TNC、USP22及Ki-67蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系 TNC蛋白高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小和組織學(xué)分類無關(guān)(P>0.05)，與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和臨床分期相關(guān)(P<0.05，表1)。USP22和Ki-67蛋白高表達(dá)均與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和臨床分期呈正相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小和組織學(xué)分類均無關(guān)(P>0.05，表1)。

2.3 TNC、USP22及Ki-67 mRNA在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá) 肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中TNC、USP22和Ki-67 mRNA表達(dá)均增強，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而肺腺癌組和肺鱗狀細(xì)胞癌組相比，TNC、USP22及Ki-67 mRNA的表達(dá)強度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

3 討論

TNC是細(xì)胞外基質(zhì)中具有獨特六臂結(jié)構(gòu)的寡聚糖蛋白，在胚胎期一過性高表達(dá)，至機體發(fā)育成熟表達(dá)減弱，具有創(chuàng)傷修復(fù)、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化等作用。研究顯示TNC在多種惡性腫瘤如乳腺癌、腸癌、非小細(xì)胞肺癌及前列腺癌等腫瘤中均高表達(dá)，且表達(dá)強度與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。最近有關(guān)TNC在非小細(xì)胞肺癌中的研究已有報道，2014年葛忠虎等[5]展開了TNC在非小細(xì)胞肺癌中的病理研究，并分析得出TNC表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的分類、腫瘤直徑和病理分級無關(guān)，與TNM分期、有無胸膜浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測TNC表達(dá)可能有助于非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，關(guān)于TNC在非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)與其浸潤轉(zhuǎn)移的機制卻知之甚少。2015年Tang等[6]發(fā)現(xiàn)TNC可與細(xì)胞表面黏附分子整合素αvβ3結(jié)合，激活αvβ3-KRAS-rALB-NFκB信號通路并促進肺腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。2017年Gocheva等[7]提出通過CRISPR介導(dǎo)的內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄激活，可增加TNC表達(dá)水平，促進肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴散，且TNC表達(dá)越高肺腺癌的預(yù)后越差。本實驗檢測了TNC在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、臨床分期以及組織學(xué)分類的相關(guān)性。RT-PCR和免疫組化結(jié)果均顯示TNC在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示TNC表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌組織學(xué)分類無關(guān)。同時本實驗結(jié)果表明，TNC高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及臨床分期有關(guān)，且分化程度越高、臨床分期越早TNC表達(dá)越強，這一結(jié)論與葛忠虎等[5]在非小細(xì)胞肺癌中的研究結(jié)果一致，表明TNC表達(dá)增強對于非小細(xì)胞肺癌的浸潤轉(zhuǎn)移具有一定的抑制效應(yīng)。本實驗亦發(fā)現(xiàn)TNC主要表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌巢周邊細(xì)胞外基質(zhì)及基膜，提示間質(zhì)中TNC的聚集可能是抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的重要屏障，這一結(jié)論已經(jīng)在乳腺導(dǎo)管癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤的研究中得到證實?？梢?，檢測TNC表達(dá)對判斷非小細(xì)胞肺癌患者的惡性程度及預(yù)后有重要意義。

ABCDEF

圖1 TNC、USP22及Ki-67蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)，SP法：A.TNC在肺鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，定位于細(xì)胞外基質(zhì)、基膜；B.TNC在肺腺癌中高表達(dá)，定位于細(xì)胞外基質(zhì)、基膜；C.USP22在肺鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，定位于細(xì)胞核；D.USP22在肺腺癌中高表達(dá)，定位于細(xì)胞核；E.Ki-67在肺鱗狀細(xì)胞癌中陽性，定位于細(xì)胞核；F.Ki-67在肺腺癌中陽性，定位于細(xì)胞核

表1 TNC、USP22及Ki-67蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖2 TNC、USP22及Ki-67 mRNA在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)：A.RT-PCR的典型電泳結(jié)果；B.3次獨立實驗的單因素方差檢驗；與對照組相比，**P<0.01

USP22是一種調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的去泛素酶，研究報道USP22與人轉(zhuǎn)錄復(fù)合物SAGA(human Spt-Ada-Gcn5-acet-yltransferase)的亞單位結(jié)合，促使SAGA乙?；旧w上的組蛋白(H2A、H2B)，激活基因的轉(zhuǎn)錄，促進細(xì)胞由G1/S、G2/M期過渡，促使腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[8]。USP22可促進多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖，為腫瘤預(yù)后不良基因。Xiao等[9]發(fā)現(xiàn)USP22高表達(dá)可促進鼻咽癌細(xì)胞活力和增殖，miR-34B可通過靶向調(diào)控USP22抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。Okamoto等[10]通過敲除USP22基因，降低USP22的表達(dá)，抑制惡性胸膜間皮瘤細(xì)胞的體外增殖。Zhang等[11]研究證實USP22在骨肉瘤中高表達(dá)，下調(diào)USP22基因表達(dá)后，可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并阻滯細(xì)胞周期。本組中RT-PCR和免疫組化結(jié)果均提示，與正常對照組相比，非小細(xì)胞肺癌組織中USP22蛋白和mRNA表達(dá)均增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并且淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、分化程度越低、臨床病理分期越晚時，USP22表達(dá)越強。提示USP22高表達(dá)可能使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖調(diào)控受到影響，從而導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞異常增殖。本實驗中，中分化組USP22的陽性率顯著高于低分化組，可能是由于樣本量不足，還需要后期增加每組樣本量繼續(xù)進行深入分析?？梢奤SP22高表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的重要機制之一。

細(xì)胞增殖失控是惡性腫瘤發(fā)展的標(biāo)志，Ki-67是一種反應(yīng)細(xì)胞增殖活性的特異性核抗原。近來研究表明，Ki-67在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。關(guān)于非小細(xì)胞肺癌中Ki-67表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系已被廣泛研究，且爭議頗多。袁艷龍等[12]對79例非小細(xì)胞肺癌組織和20例肺良性病變組織分析發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型等無明顯相關(guān)性。Wen等[13]對5 600例非小細(xì)胞肺癌患者進行Meta分析，證實在亞洲非小細(xì)胞肺癌患者中Ki-67高表達(dá)與患者年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與患者性別、臨床分期、分化程度顯著相關(guān)。Warth等[14]對1 065例非小細(xì)胞肺癌患者進行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)Ki-67增殖指數(shù)與組織學(xué)亞型有關(guān)。本實驗中Ki-67在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和臨床分期呈正相關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤大小和組織學(xué)分類無關(guān)，與袁艷龍等[12]在非小細(xì)胞肺癌中的研究結(jié)果一致，而與Wen等[13]的研究結(jié)果不完全一致。原因可能是由于此次非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本量不足，仍需加大樣本量深入探討。

本實驗亦發(fā)現(xiàn)USP22與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)，提示USP22與Ki-67兩者可能在非小細(xì)胞肺癌中相互作用，共同促進細(xì)胞增殖，這一結(jié)論已經(jīng)在食管鱗癌中得到證實[8]。但仍需進一步實驗證實非小細(xì)胞肺癌中兩者之間的關(guān)系。隨著對腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移研究的逐漸深入，有效的將TNC與USP22及Ki-67的指標(biāo)聯(lián)合檢測，并探討三者在非小細(xì)胞肺癌浸潤轉(zhuǎn)移中的相互作用機制，有望為非小細(xì)胞肺癌的治療及預(yù)后提供新思路。