閆靜波，李 輝，衛(wèi) 茹，齊 蕾，王 博

胰腺癌的發(fā)生是多因素共同作用的復(fù)雜過程。90%以上的胰腺癌為導(dǎo)管腺癌，其來源于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，是惡性度較高預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。近年來胰腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢[1]。因此，現(xiàn)階段胰腺導(dǎo)管腺癌的早期篩查診斷和新的標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)具有重要意義。細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase 1, CHK1)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤耐藥性等方面發(fā)揮重要作用，在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，是一種細(xì)胞檢驗(yàn)點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[2]。DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白(RAD51)能夠促進(jìn)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，是一種DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白[3]。本文采用Western blot法及免疫組化EnVision法檢測CHK1及RAD51蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)，分析兩者在胰腺導(dǎo)管腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2006～2017年河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科存檔的103例胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本?；颊咝g(shù)前均未行放、化療。103例中男性68例，女性35例；年齡<60歲者45例，≥60歲者58例；腫瘤最大直徑<2 cm 35例，≥2 cm 68例；組織學(xué)分級(jí)：高分化41例，中+低分化62例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者50例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者53例；腫瘤分期：Ⅰ+Ⅱ期63例，Ⅲ+Ⅳ期40例。另收集癌旁正常胰腺標(biāo)本(取自胰腺癌標(biāo)本距離腫瘤邊緣3 cm以外的正常胰腺組織)103例。

胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本和癌旁正常胰腺標(biāo)本，均分兩種方法保存：一種液氮凍存，行Western blot法檢測；另一種經(jīng)10%中性福爾馬林固定保存，行常規(guī)HE及免疫組化染色。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 采用免疫組化EnVision法檢測CHK1及RAD51蛋白表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。(1)根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比值計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。(2)根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度來計(jì)分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：≥2分為陽性，0～1分為陰性。

1.2.2 Western blot法 對(duì)癌旁正常胰腺標(biāo)本和胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本的蛋白進(jìn)行提取，然后繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白含量，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，硝酸纖維素膜經(jīng)TBS振蕩漂洗2次，5%BSA常溫振蕩封閉。TBST振蕩漂洗3次，在膜上滴加封閉液稀釋的抗鼠單克隆一抗(CHK1及RAD51)，4 ℃過夜。次日回收一抗，TBST振蕩漂洗硝酸纖維素膜3次。在膜上滴加二抗，室溫1 h，TBST振蕩漂洗3次，TBS振蕩漂洗。加入堿性磷酸酶顯色劑顯色，見有清晰條帶出現(xiàn)即用雙蒸水終止顯色。將硝酸纖維素膜用掃描儀對(duì)蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行灰度掃描，經(jīng)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，癌旁正常胰腺標(biāo)本組的平均光密度值(OD值)取值為1，胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本與正常胰腺標(biāo)本相比取值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)CHK1及RAD51蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌和癌旁正常胰腺組織中的表達(dá)及與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床病理特征的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測CHK1及RAD51蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示：CHK1及RAD51蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05，表1，圖1、2)。

①A①B①C②A②B②C

圖1 CHK1在癌旁正常胰腺(A)、高分化胰腺導(dǎo)管腺癌(B)和低分化胰腺導(dǎo)管腺癌(C)中的表達(dá)，EnVision法 圖2 RAD51在癌旁正常胰腺(A)、高分化胰腺導(dǎo)管腺癌(B)和低分化胰腺導(dǎo)管腺癌中(C)的表達(dá)，EnVision法

表1 免疫組化法檢測CHK1及RAD51蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌及癌旁正常胰腺組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 Western blot法檢測CHK1及RAD51蛋白表達(dá) Western blot法結(jié)果顯示：CHK1及RAD51在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05，表2，圖3)。

表2 Western blot法檢測CHK1及RAD51蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌及癌旁正常胰腺組織中的表達(dá)

圖3 Western blot法檢測CHK1及RAD51蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌及癌旁正常胰腺組織中的表達(dá)：1.癌旁正常胰腺；2.胰腺導(dǎo)管腺癌

2.3 CHK1及RAD51蛋白表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床病理特征的關(guān)系 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：CHK1及RAD51蛋白表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期相關(guān)(P<0.05)。CHK1及RAD51蛋白在中+低分化胰腺導(dǎo)管腺癌組中的表達(dá)高于高分化組；CHK1及RAD51蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺導(dǎo)管腺癌組中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；CHK1及RAD51蛋白在Ⅲ+Ⅳ期胰腺導(dǎo)管腺癌組中的表達(dá)高于Ⅰ+Ⅱ期組(表3)。

2.4 CHK1和RAD51蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，胰腺導(dǎo)管腺癌組織中CHK1和RAD51蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.514 3，P<0.05)。

3 討論

胰腺導(dǎo)管腺癌是胰腺癌最常見的病理類型，發(fā)生于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。胰腺癌發(fā)病隱匿，診治困難，是惡性度較高預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[4]。胰腺癌的病因復(fù)雜，膽道系統(tǒng)疾病或基因突變可能是胰腺癌發(fā)生的基礎(chǔ)因素。有研究結(jié)果顯示，分子生物或基因調(diào)控的變化是胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的另一重要因素[5]。分子蛋白的改變，導(dǎo)致癌細(xì)胞的生物學(xué)改變，影響癌細(xì)胞的周期調(diào)控及基因修復(fù)，增強(qiáng)其基因不穩(wěn)定性，從而增加腫瘤易感性，促進(jìn)腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移[6]。本組實(shí)驗(yàn)分析RAD51和CHK1蛋白表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，能夠?yàn)橐认侔┑脑缙诤Y查及預(yù)后評(píng)估提供新的標(biāo)志物，探討胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，為胰腺癌的治療尋找新的方法和途徑。

CHK1是一種細(xì)胞檢驗(yàn)點(diǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，可以對(duì)各種因素導(dǎo)致的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，其異常表達(dá)會(huì)造成周期檢測點(diǎn)不能修復(fù)機(jī)體DNA的損傷，引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。研究表明，CHK1與腫瘤的多藥耐藥性、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤中表達(dá)升高[8-9]。RAD51蛋白是一種參與同源重組修復(fù)的DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白[10]。然而，RAD51蛋白升高會(huì)增加姐妹染色體的交換及同源重組，從而增加遺傳的差異和基因的不穩(wěn)定，加速瘤細(xì)胞增殖，造成瘤細(xì)胞分化成熟障礙及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。RAD51蛋白的一些氨基酸突變也會(huì)滅活該基因，引起腫瘤的發(fā)生[11]。

表3 CHK1及RAD51表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床病理特征的關(guān)系

CHK1和RAD51蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05)。CHK1及RAD51蛋白表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期相關(guān)(P<0.05)。CHK1及RAD51蛋白在中+低分化胰腺導(dǎo)管腺癌組中的表達(dá)高于高分化組；CHK1及RAD51蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺導(dǎo)管腺癌組中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；CHK1及RAD51蛋白在Ⅲ+Ⅳ期胰腺導(dǎo)管腺癌組中的表達(dá)高于Ⅰ+Ⅱ期組。隨著胰腺導(dǎo)管腺癌的進(jìn)展，CHK1和RAD51蛋白表達(dá)升高，且CHK1和RAD51蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示CHK1和RAD51蛋白可能共同促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生、發(fā)展。隨著腫瘤的進(jìn)展，惡性程度的增高，CHK1和RAD51蛋白表達(dá)升高。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期高的胰腺導(dǎo)管腺癌中，CHK1和RAD51蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，提示CHK1和RAD51蛋白可能促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，促使胰腺導(dǎo)管腺癌的生長加速，提高胰腺導(dǎo)管腺癌的臨床分期，臨床分期高和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后較差。由此推測，CHK1和RAD51蛋白可能與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)系，CHK1和RAD51蛋白可能是胰腺導(dǎo)管腺癌分級(jí)分期的重要標(biāo)志，兩者能夠作為胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)，這與作者先前研究的CHK1和RAD51在食管、胃結(jié)合部癌的研究結(jié)果相同[12-13]。

有研究結(jié)果表明，CHK1和RAD51蛋白在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高，瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性增加，因此CHK1和RAD51蛋白升高的腫瘤患者，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療及放療不敏感[11,14]。以CHK1和RAD51為靶點(diǎn)，基因治療技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，能夠使瘤細(xì)胞對(duì)放、化療的敏感性增強(qiáng)，是治療腫瘤的新途徑[11,14]。因此，CHK1和RAD51蛋白有可能成為治療胰腺導(dǎo)管腺癌的新靶點(diǎn)。

CHK1及RAD51蛋白表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期相關(guān)。隨著胰腺導(dǎo)管腺癌的進(jìn)展，CHK1和RAD51蛋白表達(dá)升高。研究結(jié)果說明：CHK1和RAD51蛋白可能與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)系。CHK1和RAD51蛋白對(duì)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要的臨床意義，其可能成為臨床上胰腺導(dǎo)管腺癌的早期篩查及預(yù)后的新標(biāo)志物。如果深入探究CHK1和RAD51蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)，CHK1和RAD51蛋白有可能成為治療胰腺導(dǎo)管腺癌的新靶點(diǎn)，給胰腺導(dǎo)管腺癌的治療帶來新途徑。