程 玉，劉海旺，郝美玲，薛 晶，齊潔敏

最新數(shù)據(jù)顯示，2018年全球新增胃癌病例100萬(wàn)，死亡病例約78.3萬(wàn)，約12例中有1例死于胃癌[1]。胃癌是我國(guó)第二大惡性腫瘤，發(fā)病率遠(yuǎn)高于西方發(fā)達(dá)國(guó)家[2]。認(rèn)識(shí)胃癌發(fā)病的分子機(jī)制有助于提高胃癌的診療水平。近年研究發(fā)現(xiàn)，破壞晝夜節(jié)律平衡會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[3]，節(jié)律因子BMAL1能夠通過(guò)自身的表達(dá)調(diào)控和形成正負(fù)反饋通路而產(chǎn)生晝夜節(jié)律，其作為抑癌基因與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前，BMAL1在胃癌中是促癌作用還是抑癌作用尚存在爭(zhēng)議，且其調(diào)控胃癌發(fā)病的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也未明確[4-6]。GLI1作為Hedgehog(HH)信號(hào)通路中重要的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，能激活下游靶基因從而調(diào)控增殖、分化等多種生理功能。GLI1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，促進(jìn)多種腫瘤的進(jìn)展。胃癌中BMAL1與GLI1的表達(dá)是否具有相關(guān)性值得進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢查胃癌中BMAL1和GLI1的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系，為探索BMAL1促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2014～2018年承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的90例石蠟標(biāo)本，其中男性66例，女性24例，年齡38～81歲，中位年齡60歲，低分化52例，高中分化38例。根據(jù)2016年AJCC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，其中Ⅰ+Ⅱ期48例，Ⅲ+Ⅳ期42例。所有病例臨床、病理資料均完整，并經(jīng)病理檢查證實(shí)，患者術(shù)前均未行放、化療等輔助治療，患者均知情同意。另隨機(jī)抽取40例癌旁(距癌組織邊緣≥5 cm)組織作為對(duì)照組。

1.2 免疫組化 免疫組化染色采用EliVision兩步法。兔抗人BMAL1多克隆抗體(Ab93806，1 ∶200)及兔抗人GLI1多克隆抗體(Ab151796，1 ∶200)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)2 min，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，DAB顯色。

1.3 結(jié)果判斷 由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，采用雙評(píng)分法判斷。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘作為最終評(píng)分，總分范圍為0～12分；以≤8分為低表達(dá)(陰性)，>8分為高表達(dá)(陽(yáng)性)[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩指標(biāo)相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中BMAL1、GLI1的表達(dá) BMAL1和GLI1陽(yáng)性定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。胃癌組織中BMAL1和GLI1的陽(yáng)性率分別為86.7%(78/90)和83.3%(75/90)，兩者在癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為12.5%(5/40)和10.0%(4/40)。BMAL1和GLI1在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1，圖1～6)。

表1 BMAL1和GLI1在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 BMAL1、GLI1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 BMAL1表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤最大直徑、分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。GLI1表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤最大直徑、分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 BMAL1和GLI1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組織中BMAL1與GLI1表達(dá)的相關(guān)性 本實(shí)驗(yàn)中BMAL1和GLI1蛋白在胃癌中表達(dá)的秩相關(guān)系數(shù)為0.526(P<0.01)，即兩者表達(dá)呈正相關(guān)(表3)。

表3 胃癌組織中BMAL1和GLI1表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

所有生物體的生理功能和行為均保持強(qiáng)健的晝夜節(jié)律，生物鐘基因(PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1)組成轉(zhuǎn)錄/翻譯正負(fù)反饋回路(TTFLs)，調(diào)控晝夜生物節(jié)律。轉(zhuǎn)錄因子BMAL1(又名ARNTL)位于TTFLs核心部位，在維持正常生物節(jié)律中起至關(guān)重要的作用[8-9]。越來(lái)越多的研究證實(shí)BMAL1參與腫瘤的多種生物學(xué)行為，并且其在腫瘤中的作用具有組織特異性，如BMAL1在胰腺癌、舌鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中起抑癌作用，而在頭頸部腫瘤、髓細(xì)胞白血病等腫瘤中起促癌作用[10-13]。目前，關(guān)于BMAL1在胃癌中作用的研究相對(duì)較少，且研究結(jié)果不一致。Hu等[4]研究發(fā)現(xiàn)BMAL1在胃癌及癌旁組織中表達(dá)無(wú)差異，且與胃癌臨床生物學(xué)行為無(wú)關(guān)。魏柏等[5-6]報(bào)道BMAL1在胃癌組織中呈高表達(dá)，BMAL1的表達(dá)與患者年齡、腫瘤分化程度相關(guān)，并且認(rèn)為BMAL1基因誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增殖。研究結(jié)果的不一致，可能是因?yàn)闃颖玖坎煌?。本?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BMAL1在胃癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，提示BMAL1是胃癌組織和癌旁組織的差異蛋白，其可能在胃癌發(fā)生過(guò)程中起作用，與魏柏等研究結(jié)果一致。胃癌組織中，BMAL1在T3+T4組中的表達(dá)高于T1+T2組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N2+N3組中BMAL1表達(dá)高于N0+N1組，TNM分期Ⅲ+Ⅳ組中BMAL1的表達(dá)高于Ⅰ+Ⅱ組，表明BMAL1可能在促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用。

①②③④⑤⑥

圖1 BMAL1在癌旁組織中呈陰性，EliVision兩步法 圖2 BMAL1在高分化胃癌組織中呈陽(yáng)性，EliVision兩步法 圖3 BMAL1在低分化胃癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性，EliVision兩步法 圖4 GLI1在癌旁組織中呈陰性，EliVision兩步法 圖5 GLI1在高分化胃癌組織中呈陽(yáng)性，EliVision兩步法 圖6 GLI1在低分化胃癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性，EliVision兩步法

GLI1是HH信號(hào)通路中極其重要的一部分，可以激活大部分HH信號(hào)通路靶基因，該通路參與胚胎發(fā)生、組織分化、自我更新、體內(nèi)平衡和成體干細(xì)胞增殖[14]。哺乳動(dòng)物中HH通路的組成部分有HH配體(DHH、SHH、IHH)、膜蛋白受體復(fù)合物Patched(PTCH)和Smoothened(SMO)、核轉(zhuǎn)錄因子GLI家族及下游靶基因。在正常生理情況下，PTCH抑制SMO蛋白活性，從而抑制HH下游通路，當(dāng)PTCH和HH結(jié)合后，解除PTCH對(duì)SMO抑制作用，SMO進(jìn)入胞質(zhì)中，激活轉(zhuǎn)錄因子GLI，最后GLI鋅指轉(zhuǎn)錄因子(GLI1、GLI2、GLI3)移位進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化[15]。HH信號(hào)通路在胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后和耐藥中起關(guān)鍵作用[16]。近期有研究指出，GLI1在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，抑制GLI1基因的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力[17]。GLI1高表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖遷移、誘導(dǎo)耐藥[18]。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)GLI1在胃癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，隨著分化程度的降低，浸潤(rùn)深度的增加，TNM分期的升高，GLI1的表達(dá)亦增高，提示GLI1在胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用。

目前，BMAL1與GLI1在胃癌中的表達(dá)是否有關(guān)聯(lián)尚不清楚，有文獻(xiàn)報(bào)道HH信號(hào)通路通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子GLI與肝臟脂肪代謝晝夜節(jié)律相互反饋，BMAL1能調(diào)控HH信號(hào)通路核心基因[19]。本實(shí)驗(yàn)分析胃癌中BMAL1和GLI1表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示BMAL1和GLI1在胃癌中表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者可能協(xié)同促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，具體機(jī)制尚有待體外細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

總之，BMAL1和GLI1在胃癌組織中高表達(dá)，兩者表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，GLI1表達(dá)亦與胃癌分化程度相關(guān)。兩者可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。BMAL1、GLI1在胃癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，可能具有協(xié)同作用，為進(jìn)一步探究BMAL1在胃癌中的作用提供線索。