徐 強，宋 蒨，周 瑜，徐元豐，巢浩強， 石紅建

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球較為常見且惡性度較高的腫瘤，其病死率僅次于肺癌和胃癌，位居第3位，發(fā)病率居第5位[1-2]。由于HCC早期無明顯癥狀，且較早即發(fā)生肝內外轉移，確診時大多已是中晚期，治療效果較差，嚴重影響患者的生存期[3-5]。環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)是機體花生四烯酸的代謝產物，在促進組織再生和血管生成方面發(fā)揮重要作用，有研究顯示EETs可促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤血管的生成[6]。細胞色素P450表氧化酶2J2(cytochrome P450 arachidonic acid epoxygenase 2J2, CYP2J2)屬于P450同工酶家族，是EETs的新型代謝途徑，具有調節(jié)血管活性和細胞增殖等功能[7]。相關研究結果顯示，EETs、CYP2J2與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，但在肝癌中的作用未見相關報道[5-7]。本實驗將探討HCC中EETs、CYP2J2的表達及其與臨床病理學特征、預后的相關性，旨在為肝癌患者的診療及評估預后提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2013年1月～2016年12月江蘇大學附屬武進人民醫(yī)院經病理確診的86例HCC石蠟包埋組織為研究對象。收集患者的臨床病理資料。患者年齡34～65(48.31±8.21)歲。入組標準：(1)臨床信息完整；(2)均接受根治性HCC切除術，經病理確診為HCC；(3)均為初使治療，術前均未行放、化療；(4)診斷及分期符合美國癌癥聯合委員會(AJCC)第7版標準。

1.2 免疫組化 采用免疫組化SP法檢測HCC組織中EETs、CYP2J2的表達。具體步驟：將標本用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，放入恒溫烤箱烤片。常規(guī)脫蠟脫水，PBS沖洗，檸檬酸高壓修復，滴加對應一抗EETs(美國CST公司)、CYP2J2(美國Santa Cruz Biotechnol公司)，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗，滴加對應二抗，PBS沖洗，滴加DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。

1.3 結果判定 EETs、CYP2J2蛋白均為細胞核表達。結果判斷標準：(1)按陽性細胞所占的比例評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分；(2)按細胞染色程度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將兩項得分結果相乘：≥2分為高表達，<2分為低表達。

1.4 隨訪 患者每3個月隨訪1次，記錄患者生存時間等。隨訪截至2018年12月。

1.5 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計數資料比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較應用Log-rank檢驗。單因素及多因素分析采用Cox比例風險模型。應用Spearman分析CYP2J2和EETs表達的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織中CYP2J2和EETs的表達 86例HCC組織中36例CYP2J2高表達，高表達率為41.86%(36/86)，低表達率為58.14%(50/86)；45例EETs高表達，高表達率為52.33%(45/86)，低表達率為47.67%(41/86)(圖1)。

ABCD

圖1 A.肝細胞癌中CYP2J2蛋白高表達；B.肝細胞癌中CYP2J2蛋白低表達；C.肝細胞癌中EETs蛋白高表達；D.肝細胞癌中EETs蛋白低表達，SP法

2.2 CYP2J2和EETs表達與HCC臨床病理特征的關系 CYP2J2和EETs不同表達狀態(tài)的患者在TNM分期、分化程度、有無靜脈癌栓和淋巴結轉移方面，差異有統計學意義(P均<0.05)；CYP2J2和EETs高表達組患者更多見于Ⅲ+Ⅳ期、中+低分化、合并靜脈癌栓和淋巴結轉移(表1)。

2.3 CYP2J2和EETs表達與HCC患者預后的關系 CYP2J2低表達組患者的2年生存率為52.00%(26/50)，高于CYP2J2高表達組(30.56%，11/36)，差異有統計學意義(χ2=9.282，P=0.002)；EETs低表達組患者的2年生存率為58.54%(24/41)，高于EETs高表達組(26.67%，12/45)，差異有統計學意義(χ2=14.969，P=0.009，圖2、3)。

2.4 Cox單因素和多因素分析 單因素分析結果顯示：CYP2J2、EETs、腫瘤分化程度、分期、合并淋巴結轉移和合并靜脈癌栓與肝癌患者預后顯著相關(P<0.05)。多因素分析結果顯示：CYP2J2、EETs為影響肝癌患者預后的危險因素(P<0.05，表2、3)。

2.5 HCC組織中CYP2J2和EETs表達的相關性 經Spearman等級相關檢驗發(fā)現，CYP2J2和EETs蛋白表達呈正相關(r=0.810，P<0.001，表4)。

3 討論

HCC是原發(fā)性肝癌中最常見的類型，其發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢，發(fā)病率位居我國癌癥發(fā)病率的第5位，2018年全球約有78萬例新發(fā)肝癌患者，半數以上發(fā)生于我國[8]。以肝癌切除術為主，以化療、放療和靶向治療為輔的綜合治療，大大改善了肝癌患者的預后，但即使行根治性切除術，HCC術后復發(fā)率仍較高[9]。因此，尋找可靠的標志物和行之有效的干預靶點，有助于肝癌的早期發(fā)現和治療，進而改善肝癌患者預后和提高存活率。EETs是花生四烯酸經細胞色素P450代謝生成，在調節(jié)炎癥、促進血管生成等過程中發(fā)揮重要作用，另可通過下調抗凋亡蛋白的表達防止腫瘤細胞凋亡，能明顯促進腫瘤的遷移和侵襲。CYP2J2是P450同工酶家族的一員，廣泛分布于肝臟、肺臟等內臟器官以及血管內皮細胞中，參與體內多種生理、病理過程，越來越多的研究發(fā)現其在食管癌、肺癌等多種腫瘤中高表達，可促進腫瘤細胞的增殖和轉移。

相關研究[10-11]顯示，EETs及CYP2J2與多種腫瘤的臨床病理學特征具有明顯的相關性。本組實驗結果顯示，EETs及CYP2J2與HCC患者臨床病理特征顯著相關。CYP2J2和EETs不同表達狀態(tài)的患者在TNM分期、分化程度、有無靜脈癌栓和淋巴結轉移方面，差異有統計學意義(P均<0.05)；CYP2J2和EETs高表達患者更多見于Ⅲ+Ⅳ期、中+低分化、合并靜脈癌栓和淋巴結轉移。EETs及CYP2J2高表達患者更多見于腫瘤分期較晚、分化程度更低、且更易合并靜脈癌栓和淋巴結轉移等，均是影響HCC患者的預后危險因素。EETs及CYP2J2的表達狀態(tài)與HCC病灶的直徑無明顯相關性，提示HCC大小可能更多與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的時間有關。相關研究[12]表明，CYP2J2的表達狀態(tài)與腫瘤患者的生存時間明顯相關。本組實驗結果顯示，CYP2J2低表達患者的生存期比CYP2J2高表達患者的生存期更長。Jiang等[13]的研究結果顯示，過表達CYP2J2可通過影響腫瘤直徑和腫瘤的生長速度影響腫瘤患者的預后，且經CYP2J2代謝衍生的EETs可通過影響tetraspanin、MMP和E-cadherin等黏附分子的表達促進癌細胞的增殖和遷移。另一項納入了101例腫瘤患者的研究[14]顯示，77%的腫瘤患者中CYP2J2呈高表達，CYP2J2高表達的患者預后較差。

表1 CYP2J2和EETs蛋白表達與肝細胞癌臨床病理特征的關系

圖2 CYP2J2不同表達組腫瘤患者的生存曲線

圖3 EETs不同表達組腫瘤患者的生存曲線

表2 肝細胞癌患者生存時間的單因素Cox回歸分析

RR：相對危險度

表3 肝細胞癌患者生存時間的多因素Cox回歸分析

RR：相對危險度

表4 肝細胞癌中CYP2J2和EETs蛋白表達的相關性

本組實驗結果顯示，HCC中EETs低表達組患者的生存期高于EETs高表達組，這與Nithipatikom等[15]觀點一致，認為EETs低表達患者的生存時間高于EETs高表達患者。EETs高表達患者的預后更差，其原因可能是EETs通過直接刺激腫瘤細胞生長和抑制腫瘤細胞凋亡，在體內和體外促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展，因此當EETs表達上調，腫瘤細胞增殖能力加強，更易發(fā)生淋巴結轉移及遠處轉移，患者的病情發(fā)展較快，影響患者的治療和預后[16]。EETs抑制劑可通過破壞線粒體，激活c-Jun NH2-末端激酶、Caspase-3和胱天蛋白酶-9促進腫瘤細胞凋亡。單因素和多因素回歸分析結果顯示，EETs、CYP2J2均為影響HCC患者生存時間的危險因素。經相關性分析顯示，EETs和CYP2J2的表達具有明顯相關性，提示兩者在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中共同發(fā)揮作用。因此，EETs和CYP2J2均可能成為HCC患者的治療靶點，通過特異阻斷兩者的功能，延緩病情的進展，改善HCC患者的預后。另外，對于HCC患者，可通過檢測EETs和CYP2J2蛋白的表達狀態(tài)，對HCC患者的預后進行評估。

綜上所述，CYP2J2和EETs表達狀態(tài)與HCC臨床病理特征具有明顯相關性；且CYP2J2、EETs為影響HCC患者預后的危險因素。CYP2J2和EETs能為HCC患者的診療及預后預測提供參考依據。