王文軍，何 雷，李佳嘉，徐國祥，徐五琴，盧林明,2

胃癌發(fā)病率及病死率位居我國惡性腫瘤的第2位[1]，晚期胃癌生存率低，尚缺乏特異的腫瘤標(biāo)志物及有效的預(yù)后指標(biāo)。二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase Ⅳ, DPPⅣ)于1966年由Hopsu-Havu和Glenner[2]首次在大鼠肝臟組織中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可降解含DPP肽鏈結(jié)構(gòu)的水解酶；1991年發(fā)現(xiàn)其兼具T細(xì)胞活化功能，又稱其為CD26[3]。DPPⅣ/CD26除了作為一種蛋白酶及免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)因子外，其在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中既作為腫瘤抑制因子，又被認(rèn)為是腫瘤促進(jìn)因子，作用尚不一致[4]。目前，CD26在胃癌組織中表達(dá)的研究鮮有報(bào)道，本文采用免疫組化EliVision Super法檢測CD26蛋白在人胃癌腫瘤細(xì)胞及腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)中的表達(dá)特征，并分析其表達(dá)與臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的相關(guān)性，以期為胃癌早期診斷、預(yù)后判斷及臨床治療提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年1月～2017年7月皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院病理科存檔的石蠟包埋組織。實(shí)驗(yàn)組均為手術(shù)切除的部分胃或全胃組織，合計(jì)90例(病理診斷均為胃腺癌)，其對應(yīng)的90例癌旁正常胃黏膜組織(距離腫瘤邊緣約5 cm)及18例胃上皮內(nèi)瘤變組織(其中低級別上皮內(nèi)瘤變12例，高級別上皮內(nèi)瘤變6例，均為胃內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)標(biāo)本)作為對照組。胃上皮內(nèi)瘤變患者18例，男性12例，女性6例；年齡43～79歲，平均61歲，中位年齡62歲。所有病例均由兩位高年資病理醫(yī)師根據(jù)WHO(2010)消化系統(tǒng)胃腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷，患者術(shù)前均未行任何放療及化療。

1.2 試劑 濃縮型鼠抗人DPPⅣ/CD26單克隆抗體(OTI11D7)購自美國ORIGENE公司，EliVision Super免疫組化試劑盒(鼠/兔廣譜型)、PBS緩沖液、pH 9.0 EDTA修復(fù)液和DAB顯色液等均購自福州邁新公司。

1.3 TILs百分比判讀標(biāo)準(zhǔn) TILs主要有以下幾種分布方式：腫瘤內(nèi)部浸潤的淋巴細(xì)胞散在分布于腫瘤細(xì)胞巢內(nèi)，并與腫瘤細(xì)胞直接接觸，沒有明顯的聚集趨勢，即腫瘤內(nèi)TIL(intratumoral TIL, iTu-TIL)；腫瘤浸潤邊界以內(nèi)的間質(zhì)中未與癌細(xì)胞直接接觸的淋巴細(xì)胞，包括浸潤邊界區(qū)的淋巴細(xì)胞，即間質(zhì)TIL(stromal TIL, sTIL)；還有一部分淋巴細(xì)胞遠(yuǎn)離浸潤邊界區(qū)，浸潤的淋巴細(xì)胞較豐富并集中分布，通常呈淋巴樣聚集，甚至在一些病例中可見淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu)形成，即三級淋巴結(jié)構(gòu)[5]。

參照2014年乳腺癌國際TILs工作組推薦的HE切片中重點(diǎn)關(guān)注sTIL的評價(jià)方法[6]，并綜合2019年胃癌TILs評分系統(tǒng)[7]。本實(shí)驗(yàn)TILs百分比是指在HE染色高倍視野下，觀察腫瘤中心區(qū)域內(nèi)iTu-TIL和腫瘤浸潤邊界以內(nèi)sTIL的TILs總和占總間質(zhì)面積的百分比，取整個(gè)HE染色切片區(qū)域的平均值；排除腫瘤區(qū)域內(nèi)人為擠壓、壞死、玻璃樣變以及先前胃鏡活檢部位的浸潤性淋巴細(xì)胞；排除腫瘤邊界之外、低級別/高級別上皮內(nèi)瘤變及正常腺體周圍的浸潤性淋巴細(xì)胞；所有單個(gè)核細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞)均應(yīng)評價(jià)，但白細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)除外。由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法分別觀察切片評分后再取平均值。

1.4 免疫組化 上述存檔蠟塊組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片。采用免疫組化EliVision Super法檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組腺上皮細(xì)胞及TILs中CD26的表達(dá)。所用抗體采用pH 9.0 EDTA修復(fù)液高壓修復(fù)，DAB顯色。以PBS代替一抗作為空白對照，以已知陽性病例作陽性對照。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 判讀標(biāo)準(zhǔn) CD26表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，染色呈淡黃色至棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。CD26結(jié)果判定結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合分級。(1)按染色強(qiáng)度評分：不著色為0分，淡黃色為1分，黃褐色為2分，棕褐色為3分。(2)陽性細(xì)胞百分率評分：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～1分為陰性，≥2分為陽性；陽性率按陽性例數(shù)除以總例數(shù)計(jì)算。由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法分別觀察切片，若觀察結(jié)果相差3分則重新評定。

1.6 隨訪 患者隨訪結(jié)果來自出院患者的電話隨訪記錄。本實(shí)驗(yàn)中觀察的指標(biāo)為總生存期，定義為從手術(shù)日到患者死亡時(shí)間，未死亡患者則記錄最后一次隨訪時(shí)間。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，使用GraphPad 5.0軟件作圖。組間比較及相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)。生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，單因素生存曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD26的表達(dá)及TILs百分比 CD26表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分為細(xì)胞膜。胃癌腫瘤細(xì)胞的陽性率為67.8%(61/90)(圖1A)，部分腺體腔緣呈線性著色，高級別上皮內(nèi)瘤變組織陽性率為50%(3/6)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.800，P=0.397>0.05)；低級別上皮內(nèi)瘤變(χ2=20.234，P<0.001)及癌旁正常胃黏膜組織均不表達(dá)CD26，與胃癌組織相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高級別上皮內(nèi)瘤變的CD26陽性率均高于低級別上皮內(nèi)瘤變(χ2=7.200，P=0.025)及癌旁正常胃黏膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

TILs百分比5%～50%，平均17.7%，中位數(shù)15%；以平均百分比為界值(cut-off)，將TILs分為<17.7%的低百分比51例(51/90，56.7%)和≥17.7%的高百分比39例(39/90，43.3%)。CD26在胃癌TILs(圖1B)、低級別和高級別上皮內(nèi)瘤變及癌旁正常胃黏膜間質(zhì)淋巴細(xì)胞中均不表達(dá)。

AB

圖1 CD26的表達(dá)：A.在胃癌腫瘤細(xì)胞中呈陽性；B.在胃癌腫瘤細(xì)胞中呈陽性，在TILs中呈陰性，EliVision Super法

表1 CD26在各組上皮成分中的表達(dá)

χ2值和P值表示胃低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變及胃腺癌分別與癌旁正常胃黏膜比較

2.2 胃癌腫瘤細(xì)胞CD26表達(dá)與臨床病理特征及TILs百分比之間的相關(guān)性 胃癌腫瘤細(xì)胞CD26的表達(dá)與浸潤深度和pTNM分期呈正相關(guān)，即浸潤深度越深、pTNM分期越高，CD26陽性率越高(P<0.05)，而與其它臨床病理特征及TILs百分比均無明顯相關(guān)性(P>0.05，表2)。

表2 胃癌腫瘤細(xì)胞CD26表達(dá)與臨床病理特征及TILs百分比之間的相關(guān)性

2.3 單因素生存分析 隨訪截至2019年5月31日，術(shù)后隨訪3～40個(gè)月，無失訪病例，隨訪期間死于胃腺癌者24例，占26.7%(24/90)。CD26陽性者總生存率為67.2%(41/61)，陰性者總生存率為86.2%(25/29)，胃腺癌腫瘤細(xì)胞中CD26陽性者較陰性者總生存期短(χ2=4.900，P<0.05)(圖2A)。腫瘤細(xì)胞CD26的表達(dá)、腫瘤大小(χ2=23.934，P<0.01)、浸潤深度(χ2=12.936，P<0.01)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=103.421，P<0.01)和pTNM分期(χ2=38.081，P<0.01)(圖2B)均為胃癌不良預(yù)后因素，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 胃癌腫瘤細(xì)胞CD26表達(dá)、pTNM分期與總生存期曲線：A.CD26蛋白陽性者較陰性者總生存期短(P<0.05)；B.pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期者較Ⅰ+Ⅱ期者總生存期短(P<0.01)

2.4 多因素Cox回歸模型分析結(jié)果 將胃癌腫瘤細(xì)胞中CD26的表達(dá)、腫瘤大小、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和pTNM分期納入Cox回歸模型，分析結(jié)果顯示：腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和pTNM分期均為影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，腫瘤細(xì)胞中CD26的表達(dá)、浸潤深度并非獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P>0.05，表3)。

表3 胃癌預(yù)后的Cox多因素回歸分析

3 討論

人DPPⅣ/CD26基因定位于2q24.3，編碼一條包含766個(gè)氨基酸的多肽鏈，其相對分子質(zhì)量為11.0×104，通常以同源二聚體的形式存在，是一種Ⅱ型跨膜蛋白，主要由三部分構(gòu)成，包括胞膜內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)、胞膜外區(qū)，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員，是一個(gè)廣泛分布的絲氨酸蛋白酶。

CD26在不同腫瘤、同一腫瘤的不同研究中的表達(dá)模式及功能不同，而且在同一表達(dá)模式下其功能可能也不一致。如在結(jié)直腸癌[8]、胰腺導(dǎo)管癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]、尿路上皮癌[11]、惡性間皮瘤[12]等腫瘤組織中均較其相應(yīng)正常組織表達(dá)高，在腫瘤細(xì)胞生長、增殖及侵襲中發(fā)揮促癌作用。而在惡性黑色素瘤[13]、非小細(xì)胞肺癌[14]中表達(dá)缺失或下調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞生長、遷移及成瘤。卵巢癌和膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)的CD26，在同一腫瘤不同研究中既顯示促癌作用[15-16]，亦顯示抑癌作用[17-18]。前列腺癌中CD26過表達(dá)[19]和下調(diào)[20]均與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。由此可見，CD26在各種腫瘤中的表達(dá)模式及功能作用表現(xiàn)的非常復(fù)雜。

目前CD26在胃癌中的文獻(xiàn)報(bào)道尚少。據(jù)有限的報(bào)道顯示，CD26在胃腸道如結(jié)腸正常腺上皮中不表達(dá)[8]，在結(jié)腸腺瘤和腺癌中均有表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，且呈現(xiàn)腔緣線性表達(dá)的特點(diǎn)[21]。Carl-McGrath等[22]的研究結(jié)果顯示CD26在正常胃黏膜表面上皮和小凹上皮(4/10)偶有表達(dá)，定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，胃黏膜固有層腺體不表達(dá)，腸化生上皮(3/3)和胃腺癌腫瘤細(xì)胞(7/10)中表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD26在癌旁正常胃黏膜(0/90)及低級別上皮內(nèi)瘤變(0/12)腺上皮內(nèi)均不表達(dá)，在胃高級別上皮內(nèi)瘤變(3/6)及胃腺癌(61/90)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分為細(xì)胞膜，也可見腔緣線性表達(dá)的特點(diǎn)。CD26蛋白在正常胃黏膜及低級別上皮內(nèi)瘤變組織中不表達(dá)，在高級別上皮內(nèi)瘤變的胃癌前病變到胃癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)逐漸增強(qiáng)，提示其在胃癌的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可作為胃癌早期診斷的候選標(biāo)志物。但限于低級別和高級別上皮內(nèi)瘤變病例較少，其結(jié)果和意義有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。

隨著浸潤深度和pTNM分期的提高，CD26陽性率呈正相關(guān)的升高趨勢(P<0.05)，提示高表達(dá)CD26促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步侵襲和進(jìn)展。其可能機(jī)制為：(1)CD26過表達(dá)后上皮相關(guān)的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)相關(guān)的標(biāo)志物N-cadherin和vimentin等表達(dá)上調(diào)[8]，促進(jìn)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。(2)CD26作為一種蛋白酶與腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)、纖連蛋白、膠原蛋白等配體的結(jié)合，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)中膠原蛋白的降解[23]，有利于腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。(3)新鮮胃癌組織及4種胃癌細(xì)胞系異體移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[24]，CD26+CD44+細(xì)胞較CD26+CD44-細(xì)胞和CD26-CD44-細(xì)胞增殖速度快、成瘤能力強(qiáng)，提示CD26和CD44是胃癌干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)標(biāo)志物。(4)IL-17通過信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)，將CD26-CXCR4-[CXC趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor 4, CXCR4)]靜息狀態(tài)的胃癌CSC激活為CD26+CXCR4+侵襲狀態(tài)的胃癌CSC，誘導(dǎo)EMT，促使胃癌CSC更具遷移性、侵襲性和成瘤能力[25]。(5)CD26過表達(dá)激活了缺血誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factors-1α, HIF-1α)與血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)信號通絡(luò)，通過促進(jìn)腫瘤血管生成影響腫瘤生長[10]。

CD26除了在腫瘤細(xì)胞表達(dá)外，在腫瘤細(xì)胞周邊的間質(zhì)中也可見CD26陽性細(xì)胞，包括梭形的纖維母細(xì)胞、TILs[9,15]。Bailey等[26]研究認(rèn)為，CD26highTILs富含趨化因子受體，具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性及抵制凋亡的能力，利于攻擊腫瘤細(xì)胞，促使腫瘤細(xì)胞退縮；而Barreira da Silva等[27]的研究結(jié)果提示CD26+TILs抑制了CXCR3介導(dǎo)的抗腫瘤免疫，限制了TILs向腫瘤區(qū)域的浸潤，與腫瘤免疫逃逸有關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)中CD26在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞和TILs并未表達(dá)。因此，通過免疫組化染色評判CD26+TILs是否合理，TILs中CD26陰性是否與免疫組化試劑克隆號有關(guān)，CD26+TILs在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中到底扮演什么樣的角色等疑問，仍需要作進(jìn)一步的分析。

研究顯示CD26除了可作為腫瘤診斷標(biāo)志物外，也是一種非常有意義的預(yù)后評價(jià)指標(biāo)。CD26在有些腫瘤中是一種正性預(yù)后因子[13,18]，有些則為負(fù)性預(yù)后因子[8,12]。胃癌CD26+CSC是一種潛在的負(fù)性預(yù)后因子，與其更具侵襲性的表型、強(qiáng)的成瘤能力和易發(fā)生藥物耐受有關(guān)[24]。

本實(shí)驗(yàn)單因素生存分析顯示，腫瘤細(xì)胞中CD26的表達(dá)、腫瘤大小、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和pTNM分期均為影響胃癌預(yù)后的不良因素，與CD26作為一種負(fù)性預(yù)后因子研究結(jié)論類似。多因素Cox回歸模型分析顯示，腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和pTNM分期為影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，腫瘤細(xì)胞中CD26的表達(dá)、浸潤深度并非獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P>0.05)，可能與隨訪時(shí)間較短有關(guān)。

胃癌患者血清中可溶性CD26蛋白(soluble CD26, sCD26)的檢測有利于術(shù)前早期診斷及術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的判斷[28]。隨著CD26抑制劑在Ⅱ型糖尿病治療中的廣泛應(yīng)用[29]，人源性CD26單抗YS110在惡性間皮瘤等惡性腫瘤Ⅰ期人體試驗(yàn)中抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用也得到了證實(shí)[30]。

綜上所述，CD26的表達(dá)在胃癌的發(fā)生、進(jìn)展中扮演重要角色，其可作為胃癌侵襲能力、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床病理分期、早期診斷及負(fù)性預(yù)后因子的重要參考指標(biāo)。其在胃癌中的具體分子機(jī)制，sCD26血清檢測、CD26抑制劑和抗體在胃癌治療中的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步研究證實(shí)。