王瀟飛，程 光，馬艷君，董麗儒，張 爽，宋旭東

隨著癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的不斷深入，線粒體鈣穩(wěn)態(tài)與惡性腫瘤的發(fā)展關(guān)系備受重視。線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(mitochondrial calcium uniporter, MCU)是鈣流入線粒體、控制細(xì)胞能量代謝、產(chǎn)生活性氧和程序性細(xì)胞死亡的主要介質(zhì)[1]。目前研究認(rèn)為，MCU與腫瘤大小和淋巴浸潤相關(guān)，并提示有助于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的發(fā)生；推測MCU通過HIF-1α影響VEGF的表達(dá)，抑制MCU的表達(dá)顯著降低乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力[2]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討人胃癌組織中MCU表達(dá)以及對胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，為MCU能作為診治的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2015～2018年華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科存檔的60例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本和20例新鮮胃癌標(biāo)本，所有病例均由副主任級別以上病理醫(yī)師確診。本實(shí)驗(yàn)使用的臨床組織樣本均獲得患者知情同意。

1.2 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株MGC-803購于上海中喬新舟生物公司。

1.3 抗體及試劑 一抗MCU小鼠單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc)、HIF-1α、TGF-β、E-cadherin兔多克隆抗體(Proteintech Inc)、β-actin兔多克隆抗體(北京博奧森公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA消化液(HyClone公司)；胎牛血清(FUMENG GENE Inc)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)(北京索萊寶公司)，總蛋白提取試劑盒(南京凱基公司)，Transwell小室(Corning Inc)，Alexa Fluor 594標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋公司)，Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen Inc)，ECL超敏發(fā)光液(Thermo Fisher Scientific Company)，Cell counting KIT-8(同仁化學(xué)研究所)，Spermine小分子誘導(dǎo)劑(Cayman Chemical company)，Matrigel基質(zhì)膠(BD)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)和CCK-8實(shí)驗(yàn) 人胃癌細(xì)胞株MGC-803復(fù)蘇，37 ℃ 5%CO2完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，3天傳1代。在細(xì)胞對數(shù)生長期時(shí)，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)：按照每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，細(xì)胞貼壁穩(wěn)定24 h后，給予不同劑量的Spermine(12.5、25、50、100、200 μmol/mL)，每組復(fù)4孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，取出用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度并計(jì)算增殖倍數(shù)。

1.4.2 siRNA MCU轉(zhuǎn)染 參照Lip2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行操作。Opti-MEMR Ⅰ無血清培養(yǎng)基適量，稀釋Lip2000及MCU siRNA和Control siRNA，將稀釋后的Lip2000與siRNA混勻，其中siRNA轉(zhuǎn)染的濃度是100 nmol/L，將Lip2000-siRNA形成的復(fù)合物于室溫環(huán)境中孵育20 min。取生長至對數(shù)期的MGC-803細(xì)胞胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以每孔8×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含血清不含抗生素)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)50%生長融合度時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，Lip2000-siRNA形成的復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，混合均勻后于培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育24 h，更換培養(yǎng)基(含血清和抗生素)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞檢測各組細(xì)胞中MCU的蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)使用的干擾MCU序列為：hMCU siRNA-2正義鏈5′-GAAUUUGGGAGCUGUUUAUTG-3′；hMCU siRNA-2反義鏈5′-AUAAACAGCUCCCAAAUU CTG-3′。文中以siRNA MCU表示。

1.4.3 免疫組化 免疫組化染色采用SP法。石蠟包埋胃癌組織和癌旁組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸洗，抗原修復(fù)后，一抗4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，二抗37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次，DAB顯色，復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，400倍光鏡下觀察蛋白表達(dá)情況并拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)測量各組蛋白的平均光密度。

1.4.4 免疫熒光 新鮮胃癌組織和癌旁組織冷凍切片，經(jīng)95%乙醇固定，PBS水洗，1%Triton-100，37 ℃孵育15 min，PBS水洗3遍，山羊血清工作液封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS沖洗3次，抗衰減DAPI染核，熒光顯微鏡下，400倍光觀察熒光表達(dá)并拍照。應(yīng)用 Image-Pro Plus 6.0 圖像處理系統(tǒng)測量各組蛋白的平均光密度。

1.4.5 線粒體膜電位 細(xì)胞對數(shù)增長期，接種六孔板，每孔5×105個(gè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分為對照組、Spermine組、siRNA MCU組，干預(yù)48 h，PBS洗滌。加入1 mL培養(yǎng)基工作液和1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。37 ℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。熒光顯微鏡下觀察拍照，使用IPP 6.0軟件分析[3]。

1.4.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 預(yù)先用Matrigel包被Transwell小室，將細(xì)胞接種于上室(每室5×105個(gè)細(xì)胞)，上室用無血清培養(yǎng)液，下室用含血清工作液培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定10 min，棉簽拭去上層未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，結(jié)晶紫對下層細(xì)胞染色并計(jì)數(shù)。

1.4.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 首先在6孔板背面畫2～3條橫線。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分為對照組、Spermine組、siRNA MCU組，以每孔接種6×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞鋪滿后，用20 μL槍頭垂直于橫線劃痕。PBS洗滌并加入無血清的培養(yǎng)基，于0 h和48 h使用倒置顯微鏡拍照，使用IPP 6.0軟件分析。

1.4.8 Western blot 應(yīng)用全蛋白提取試劑盒，提取前30 min配裂解液，4 ℃放置5 min，劇烈震蕩30 s，共5個(gè)循環(huán)，離心去除細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，分裝蛋白，應(yīng)用蛋白含量檢測試劑盒檢測OD值，100 ℃ 10 min煮蛋白，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。采用ECL化學(xué)發(fā)光顯影劑，曝光。應(yīng)用Image J軟件測量條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，不同時(shí)間點(diǎn)以兩者灰度值比值表示相對蛋白量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較用方差分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化和免疫熒光檢測胃癌組織和癌旁組織中MCU蛋白的表達(dá) MCU表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，以棕黃色為陽性，免疫組化和免疫熒光結(jié)果均表明，胃癌組織中MCU陽性率為72.5%(58/80例)；癌旁組織中MCU陽性率為22.5%(18/80例)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1、2)。

2.2 Western blot法檢測胃癌組織和癌旁組織中MCU蛋白的表達(dá) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，胃癌組織中MCU的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

AB

圖1 胃癌(A)組織和癌旁組織(B)中MCU蛋白的表達(dá)，SP法

圖2 胃癌(A)組織和癌旁組織(B)中MCU蛋白的表達(dá)，免疫熒光

圖3 Western blot法檢測胃癌和癌旁組織中MCU蛋白的表達(dá)

2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測Spermine對MGC-803細(xì)胞增殖的影響 應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度的Spermine對MGC-803細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示MGC-803細(xì)胞增殖率隨著誘導(dǎo)劑濃度的增加逐漸降低(圖4)。本實(shí)驗(yàn)選擇25 μmol/mL作為干預(yù)因素進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.4 不同siRNA序列對MGC-803胃癌細(xì)胞MCU蛋白表達(dá)的影響 將針對MCU干擾靶向siRNA序列轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞，Western blot法檢測轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞中MCU的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，2條siRNA均能降低MCU的表達(dá)，與對照組和Control siRNA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)，選擇抑制效果顯著的siRNA MCU-2序列作為實(shí)驗(yàn)對象。

圖4 MCU誘導(dǎo)劑Spermine對MGC-803細(xì)胞增殖的影響

圖5 siRNA MCU對MGC-803細(xì)胞MCU蛋白表達(dá)的影響

2.5 MCU對MGC-803胃癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響 利用JC-1法檢測不同分組中MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位的影響，結(jié)果顯示，Spermine能夠顯著增加MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位，且熒光強(qiáng)度較為聚集、細(xì)胞形態(tài)長梭形，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siRNA MCU組顯著降低線粒體膜電位，與對照組相比熒光強(qiáng)度顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

2.6 Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測MCU對MGC-803胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 Spermine能夠顯著增加MGC-803細(xì)胞侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)量，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；siRNA MCU組能夠顯著降低MGC-803細(xì)胞侵襲和遷移能力，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖7)。

圖6 不同分組對MGC-803胃癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖7 MCU對MGC-803胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響
*P<0.05,**P<0.01

2.7 Western blot法檢測MCU對MGC-803胃癌細(xì)胞HIF-1α、TGF-β、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，Spermine組能促進(jìn)HIF-1α、TGF-β表達(dá)和降低E-cadherin蛋白的表達(dá)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siRNA MCU干擾后顯著降低HIF-1α、TGF-β表達(dá)和上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，與對照組和Spermine組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖8)。

圖8 MCU對MGC-803胃癌細(xì)胞中HIF-1α、TGF-β、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響與對照組相比，*P<0.05；與Spermine組相比，#P<0.05

3 討論

線粒體在癌癥生物學(xué)中依賴多種分子發(fā)揮促癌作用[4]。線粒體發(fā)揮促癌的過程中，MCU通過調(diào)控線粒體鈣離子水平影響癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5]。根據(jù)人類蛋白質(zhì)圖譜(www.proteinatlas.org)多數(shù)癌組織中MCU的表達(dá)存在差異[6]。MCU調(diào)節(jié)細(xì)胞存活率、代謝、基本細(xì)胞構(gòu)建和免疫等功能，不僅影響癌癥的進(jìn)展，還影響治療效果。MCU通過線粒體內(nèi)膜將鈣轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體基質(zhì)影響癌細(xì)胞的增殖和凋亡[7]。雖然，以往研究結(jié)果表明MCU參與多部位癌轉(zhuǎn)移的過程，但是在胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用并不清楚。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCU在胃癌組織中高表達(dá)，并能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。MCU通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位影響癌癥的發(fā)展。Arduino等[8]的研究結(jié)果顯示，通過使用MCU特異性抑制劑能對血液惡性腫瘤發(fā)揮治療作用。Wiel等[9]的研究結(jié)果表明，IITPR2通過MCU通道導(dǎo)致線粒體鈣積累，影響線粒體膜電位、活性氧積累和癌細(xì)胞的衰老。本實(shí)驗(yàn)利用JC-1法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明MCU的誘導(dǎo)劑Spermine能夠顯著增加線粒體膜電位的鈣離子累積，而siRNA MCU干擾組能顯著降低線粒體膜電位。結(jié)果提示MCU對于胃癌細(xì)胞的線粒體膜電位具有調(diào)節(jié)作用。

在癌癥研究中MCU的作用仍存在爭議。研究表明，在某些癌癥中特定的Ca2+通道調(diào)控機(jī)制不同，導(dǎo)致發(fā)揮的作用也不盡相同。先前的研究結(jié)果揭示，高表達(dá)的MCU能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差[10]。在結(jié)腸癌研究中，RIPK1與MCU相互作用，通過增加線粒體鈣攝取和能量代謝促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[11]。也有研究表明，促進(jìn)MCU的表達(dá)能顯著抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移[12]。本實(shí)驗(yàn)通過Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用MCU誘導(dǎo)劑Spermine后，胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng)；而干擾MCU表達(dá)后，胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著降低。該結(jié)果表明MCU在胃癌細(xì)胞中存在促癌轉(zhuǎn)移的作用。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)與鈣離子攝取密切相關(guān)[13]。眾所周知，EMT是癌轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在EMT過程中，HIF-1α和TGF-β信號被認(rèn)為發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[14-15]。然而，MCU對EMT及其相關(guān)信號因子的關(guān)系略有不同。有研究結(jié)果表明，在TGF-β誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中MCU存在調(diào)控作用[16]。也有研究結(jié)果顯示，在三陰型乳腺癌中發(fā)現(xiàn)MCU表達(dá)與腫瘤大小和淋巴結(jié)浸潤有關(guān)，提示MCU通過調(diào)節(jié)HIF-1α促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Spermine能夠顯著增加胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，并且促進(jìn)HIF-1α和TGF-β蛋白的表達(dá)水平，干擾MCU后兩者表達(dá)顯著降低并伴有E-cadherin表達(dá)的增加。

本實(shí)驗(yàn)檢測了胃癌組織和癌旁組織中MCU的表達(dá)，結(jié)果顯示MCU在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織。在線粒體膜電位的檢測中，MCU能夠調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中線粒體鈣離子的攝取。MCU能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移，通過誘導(dǎo)和干擾MCU表達(dá)發(fā)現(xiàn)能影響HIF-1α和TGF-β的表達(dá)，表明MCU在促進(jìn)胃癌細(xì)胞的過程中，對HIF-1α和TGF-β的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。但是本實(shí)驗(yàn)并未對HIF-1α和TGF-β表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，來進(jìn)一步探討MCU的詳細(xì)作用機(jī)制，未來將進(jìn)一步闡述。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)揭示了MCU在胃癌組織中的表達(dá)水平以及促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用。MCU能影響胃癌細(xì)胞中HIF-1α和TGF-β的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)對MCU在癌癥中的作用提出了一些新參考，也為防治胃癌轉(zhuǎn)移提出新依據(jù)。