王佳潔，沈中浩，周曉龍，楊松柏，趙阿勇，汪 涵

（浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院，浙江臨安 311300）

目前，地面平養(yǎng)和籠養(yǎng)是世界范圍內(nèi)肉雞最主要的飼養(yǎng)方式。Castellini 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，平養(yǎng)模式更有利于雞肌肉發(fā)育，該模式飼養(yǎng)的雞肌肉能量和脂肪含量較低，水分含量高，腿肌肌肉氧化性強(qiáng)，飽和脂肪酸含量高，單不飽和脂肪酸水平低。雞肌肉中脂肪酸含量不僅在肌肉代謝中發(fā)揮著十分重要的生理作用，而且與雞肉風(fēng)味密切相關(guān)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，平養(yǎng)模式下，雞增重速度快，具有較大的運(yùn)動量，更有利于肌肉發(fā)育，但肌肉中營養(yǎng)成分（水分、蛋白質(zhì)、脂肪）、持水能力、剪切力、pH 等無顯著改變[3]。然而，關(guān)于不同飼養(yǎng)模式影響肉雞肌肉發(fā)育及代謝的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

當(dāng)前，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、臨床等各領(lǐng)域研究中最常用的技術(shù)手段[4]；RNAseq 技術(shù)也為篩選畜禽肌肉相關(guān)性狀差異關(guān)鍵基因及探究肌肉相關(guān)基因功能提供了至關(guān)重要的研究途徑[5-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)以不同飼養(yǎng)模式下的肉雞為研究對象，通過RNAseq 技術(shù)對2 種飼養(yǎng)模式下的肉雞腿肌進(jìn)行測序分析，篩選出與肌肉發(fā)育代謝相關(guān)的差異基因，為今后通過科學(xué)的飼養(yǎng)管理提高肉雞肌肉品質(zhì)提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 RNA 提取TRIzon Reagent 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒5X All-In-One RT Master Mix、定量試劑盒EvaGreen 2X Qpcr Master Mix 均購自蘇州愛必夢生物科技有限公司；Pax7 抗體（ab187339）、Desmin 抗體（ab6322）均購自abcam公司；Myhc 抗體（sc-20641）購自Santa Cruz Biotechnology公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、馬血清、DMEM 培養(yǎng)基均購自于HyClone 公司；青鏈霉素混合液、膠原酶、抗熒光衰減封片劑均購自于Solarbio 公司；胰酶（0.25%Trypsin-EDTA 1X）、熒光二抗（Alexa Fluor?488 goat anti-mouse IgG 和Alexa Fluor?488 goat anti-rabbit IgG）均購自于Thermo Fisher 公司；Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體購自于Invitrogen 公 司；OPTI-MEM 培養(yǎng)基購自于Gibco 公司；普通siRNA、陰性對照siRNA、EdU 檢測試劑盒（Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Kit）均購自于廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 選取210 只體重相近的1 日齡 Ross308肉雞，隨機(jī)分為2 組，籠養(yǎng)組10 個(gè)雞籠，每個(gè)雞籠6只肉雞（n=10）；地面欄養(yǎng)組10 個(gè)圍欄，每個(gè)圍欄15只雞，地面上鋪設(shè)10 cm 的新木屑（n=10）。2 組肉雞飼料相同，均根據(jù)不同階段（雛雞階段、中期階段和肉大雞階段）所需的營養(yǎng)進(jìn)行科學(xué)配比，均自由采食和飲水。在籠養(yǎng)和地面平養(yǎng)雞中各隨機(jī)選取5 只42 日齡肉雞母雞進(jìn)行稱重，計(jì)算2 組肉雞的平均日增重，隨后進(jìn)行屠宰。

10 日齡雞胚由本實(shí)驗(yàn)室取種蛋孵化10 d 后所得，種蛋購自浙江某種禽有限公司。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析

1.2.1 樣本采集及處理 使用Trizol 法提取肉雞腿肌RNA，通過北京百邁客樣品檢測中心進(jìn)行質(zhì)量檢測，保證樣品質(zhì)量滿足建庫要求。以RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.2 測序文庫構(gòu)建與序列測序 基于邊合成邊測序（Sequencing By Synthesis，SBS）技術(shù)，通過Illumina高通量測序平臺對樣品進(jìn)行測序并構(gòu)建文庫。本研究將平養(yǎng)模式和籠養(yǎng)模式下的腿肌組織分別編號為C1T-C5T和P1T-P5T，以便后續(xù)進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.3 差異基因篩選 在差異表達(dá)基因檢測過程中，將Fold Change≥2 且FDR＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)（Fold Change）表示兩樣品（組）間表達(dá)量的比值。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）是通過對差異顯著性P值（p-value）進(jìn)行校正得到的。并最終采用FDR 作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)。

1.3 熒光定量PCR 驗(yàn)證 根據(jù)NCBI 中的基因序列，通過Primer Premier.5 軟件對不同飼養(yǎng)模式下的差異基因PHGDH、ASNS、JPH2以及隨機(jī)選取的2 個(gè)任意基因LDHA、BLOC1S4以及內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由杭州有康生物技術(shù)有限公司合成，具體序列如表1。將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 模板，加入已驗(yàn)證好的引物進(jìn)行10 μL 體系的熒光定量PCR 反應(yīng)分析，反應(yīng)體系：Eva Green 2x qPCR Master Mix 5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.3 μL，Reverse Primer 0.3 μL，cDNA 3.5 μL，ddH2O 0.9 μL；qPCR 程序：95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，進(jìn)行39 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)。采用 2-△△CT法計(jì)算相關(guān)基因的相對表達(dá)水平。

表1 用于熒光定量的引物序列

1.4 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

1.4.1 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將10 日齡種蛋用酒精消毒后，置于蛋托上，用鑷子輕輕敲破蛋殼，將氣室上部蛋殼剔除，用另一把鑷子撕開氣室薄膜，注意不要污染蛋清。使用一把新鑷子將雞胚夾出，置于細(xì)胞培養(yǎng)皿上，剔除雞胚腿部肌肉皮膚后將雞胚腿部肌肉剪下，置于一個(gè)新的培養(yǎng)皿中，用含雙抗的PBS 洗滌3 次，剔除皮、血管、脂肪、結(jié)締組織。將雞胚腿部肌肉剪至肉糜狀，將肉糜吸入移至15 mL 離心管中，加入0.25%的胰酶37℃消化10 min。加入含10% FBS 的DMEM 全培養(yǎng)基終止消化，用70 μm 的濾網(wǎng)過濾到另一新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞濾液移至新的15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心8 min，棄上清，用含15%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入新的培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h 后，吸取細(xì)胞懸液至新的培養(yǎng)瓶，進(jìn)行連續(xù)平板培養(yǎng)以富集肌衛(wèi)星細(xì)胞并消除成纖維細(xì)胞，用2% 馬血清替換15% 胎牛血清誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

1.4.2 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定 取分離的雞骨骼肌衛(wèi)星進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長至70%～80%融合度時(shí)，參考Luo 等[7]采用的免疫熒光檢測方法，將培養(yǎng)的細(xì)胞用爬片處理后，對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)志基因Pax7及Desmin進(jìn)行免疫熒光染色。取另一批分離的雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，待細(xì)胞長至70%～80%融合度時(shí)，更換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，分化4 d 后對骨骼肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因Myhc進(jìn)行免疫熒光染色。隨后，用熒光倒置顯微鏡拍照。

1.5 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)不同時(shí)期的RNA 提取 取分離的雞骨骼肌衛(wèi)星進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞分裂、增殖至70%～80% 細(xì)胞融合度時(shí)，更換成分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 2、4、6 d，70%～80%細(xì)胞融合度的時(shí)間記為0 d。收集提取處于增殖期30% 細(xì)胞融合度、50% 細(xì)胞融合度、70%～80% 細(xì)胞融合度（0 d）以及處于分化期2、4、6 d 的骨骼肌細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后置于-20℃凍存。以GAPDH作為內(nèi)參基因，對關(guān)鍵差異基因PHGDH進(jìn)行熒光定量PCR 檢測分析。

1.6 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)的雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞鋪于6 孔板中，待細(xì)胞分裂、增殖至70%～80%細(xì)胞融合度時(shí)，更換無血清無雙抗培養(yǎng)基。將合成的PHGDH特異性的siRNA 試劑及陰性對照（NC）按照Lipofectamine?3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染至雞骨骼肌細(xì)胞中。將細(xì)胞放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h 后換液。

1.7 EdU 細(xì)胞增殖檢測 轉(zhuǎn)染4～6 h 后，將雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在含有10 mmol/L EdU 的新鮮生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后，每5 min 用PBS 清洗細(xì)胞2 次，隨后在每孔中加入4% 多聚甲醛進(jìn)行固定，室溫靜置30 min 后吸去細(xì)胞固定液。隨后加入2 mg/mL 的甘氨酸，置于脫色搖床孵育5 min，吸去溶液。在脫色搖床上用PBS 清洗細(xì)胞5 min，加入配制好的滲透劑，置于脫色搖床孵育10 min，再用PBS 清洗5 min。避光加入Apollo 染色反應(yīng)液，室溫下置于脫色搖床上30 min 后吸去染色反應(yīng)液。再次加入滲透劑清洗2～3 次，每次均置于脫色搖床上10 min，后棄去滲透液。每5 min 加入甲醇清洗1～2 次，再用PBS 清洗5 min。避光加入1×Hoechst 33342 反應(yīng)液，在室溫下置于脫色搖床30 min，后棄去染色反應(yīng)液。PBS 清洗3 次后封片拍照，也可避光置于4℃濕潤保存待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 日增重?cái)?shù)據(jù)分析 由圖1 可知，地面平養(yǎng)肉雞的日增重極顯著高于籠養(yǎng)肉雞。

2.2 測序質(zhì)量評估 對10 個(gè)樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測，從表2 中可以看出其中Q20 和Q30 均在90% 以上，GC 含量在49%～53%，說明測序堿基識別時(shí)出錯(cuò)的概率較低，堿基含量接近，樣本組成情況良好。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

將測序獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行Map（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)比對到參考基因組上的 Reads 數(shù)目均大于75%，比對到參考基因組唯一位置的Reads 數(shù)目在74%～92%，從比對結(jié)果統(tǒng)計(jì)來看，各樣品的Reads 與參考基因組的比對效率在78.29%～91.18%，這表明樣本的可利用率較高。綜上分析，測序數(shù)據(jù)良好，可以進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。

與此同時(shí)，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了基因表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖分析，偏離對角線的點(diǎn)越少，則說明樣本間相關(guān)性越高，樣品的重復(fù)性越好（圖2）。

2.3 差異表達(dá)基因篩選 根據(jù)差異表達(dá)的基因構(gòu)建火山圖，以-lg（FDR）為縱坐標(biāo)，log2（FC）為橫坐標(biāo)（圖3），橫坐標(biāo)表示某一個(gè)基因在兩樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)的對數(shù)值，結(jié)果表明差異基因在兩組樣品間的差異表達(dá)倍數(shù)較大。縱坐標(biāo)表示差異表達(dá)顯著性，結(jié)果表明差異基因顯著性較高，篩選得到的差異表達(dá)基因較為可靠。將FDR＜0.05 作為差異表達(dá)基因篩選條件，篩選2 組樣品中的差異表達(dá)基因，最終篩選出3 個(gè)上調(diào)基因，分別為親聯(lián)蛋白2 基因（JPH2）、3-磷酸甘油酸脫氫酶基因（PHGDH）、天冬酰胺合成酶基因（ASNS）（表4）。

表3 與參考基因組比對統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 熒光定量PCR 驗(yàn)證 圖4 顯示，3 個(gè)差異表達(dá)基因在不同飼養(yǎng)模式下的表達(dá)水平均存在顯著或極顯著的差異，而隨機(jī)選取的2 個(gè)任意基因差異不顯著。表明熒光定量PCR 驗(yàn)證的結(jié)果與RNA-Seq 中基因表達(dá)檢測的結(jié)果一致。

表4 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)表

2.5 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 結(jié)果顯示，Pax7在細(xì)胞核中呈陽性表達(dá)（圖5-A），Desmin和Myhc在細(xì)胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)（圖5-D 和圖5-G）。表明本實(shí)驗(yàn)所分離的細(xì)胞是肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。

2.6PHGDH在肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)不同時(shí)期的表達(dá)譜檢測 如圖6 所示，PHGDH基因的表達(dá)水平在細(xì)胞增殖期逐漸升高。在細(xì)胞分化第2～6 天逐漸降低，但在分化第2 天PHGDH基因的表達(dá)量顯著高于第0 天。表明PHGDH可能在不同飼養(yǎng)模式肉雞的骨骼肌形成過程中發(fā)揮重要作用。

2.7 抑制PHGDH對肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響如圖7 所示，siRNA-PHGDH組細(xì)胞與NC 對照組相比，EdU 陽性細(xì)胞的比例極顯著減少，表明處于增殖狀態(tài)下的細(xì)胞比例減少。

3 討 論

飼養(yǎng)模式是影響肉雞肌肉發(fā)育代謝的一個(gè)重要因素，已有研究表明飼養(yǎng)方式能夠很大程度上影響肉雞肌肉發(fā)育，同時(shí)也與雞肉肉質(zhì)品質(zhì)變化密切相關(guān)[8]。分析不同飼養(yǎng)模式下肉雞肌肉中差異表達(dá)的基因，對進(jìn)一步科學(xué)地利用適宜的飼養(yǎng)方式改良肉雞生長與肉質(zhì)性狀具有重要的推動作用。

本實(shí)驗(yàn)通過對平養(yǎng)和籠養(yǎng)2 種飼養(yǎng)模式下的肉雞肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共篩選出3 個(gè)與肌肉發(fā)育代謝相關(guān)的重要差異表達(dá)基因，分別為ASNS、JPH2和PHGDH基因，且差異基因均在平養(yǎng)模式雞腿肌中高表達(dá)，在籠養(yǎng)模式中低表達(dá)。ASNS 與天冬酰胺的合成密切相關(guān)，是氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一[9]。研究發(fā)現(xiàn)在仔豬日糧中添加天冬酰胺能夠有效促進(jìn)肌肉中蛋白質(zhì)的合成[10]，而在之前的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)平養(yǎng)雞肌肉中總蛋白含量要顯著高于籠養(yǎng)雞[11]。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)的ASNS基因在平養(yǎng)雞肌肉中高表達(dá)的結(jié)果，可能正是闡明飼養(yǎng)模式影響雞肌肉總蛋白含量變化的關(guān)鍵所在。JPH2 是肌肉橫管和肌質(zhì)網(wǎng)縫隙連接中的重要功能蛋白，它在維持橫管結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在肌肉中，JPH2的表達(dá)可以加快鈣離子釋放，促進(jìn)肌肉興奮-收縮耦聯(lián)機(jī)制，更有利于肌肉的運(yùn)動[12]。有研究發(fā)現(xiàn)JPH2的表達(dá)對小鼠肌肉發(fā)育至關(guān)重要[13]。平養(yǎng)模式下的肉雞運(yùn)動量往往高于籠養(yǎng)雞，運(yùn)動強(qiáng)度的增加勢必需要進(jìn)一步加快骨骼肌興奮收縮機(jī)制，因此JPH2基因的表達(dá)就顯得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)JPH2基因在平養(yǎng)雞肌肉中高表達(dá)，這進(jìn)一步說明JPH2基因可能是影響平養(yǎng)肉雞肌肉發(fā)育代謝的關(guān)鍵基因之一。PHGDH 是絲氨酸合成途徑中的限速酶，在該合成途徑中會產(chǎn)生許多代謝中間產(chǎn)物，如絲氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和磷脂等，這些產(chǎn)物對于蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長是不可或缺的[14]。盡管目前PHGDH在肌肉細(xì)胞中發(fā)揮作用的具體機(jī)制還未可知，但已有研究表明PHGDH是調(diào)控細(xì)胞生長的一個(gè)基本調(diào)節(jié)因子，過表達(dá)PHGDH能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PHGDH基因在平養(yǎng)雞肌肉中高表達(dá)，這表明在該飼養(yǎng)方式下肌肉中絲氨酸的合成速率可能較快。

對目的基因進(jìn)行表達(dá)譜檢測，通常是初步探究其生理功能的重要手段之一。鑒于PHGDH在肌肉生長發(fā)育中可能發(fā)揮的關(guān)鍵作用，本研究成功分離、鑒定并構(gòu)建了雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化模型，發(fā)現(xiàn)PHGDH基因在雞骨骼肌細(xì)胞增殖期間的表達(dá)量逐漸上調(diào)，表明PHGDH基因可能在雞骨骼肌細(xì)胞增殖過程中起到正調(diào)控作用。而已有研究發(fā)現(xiàn)，抑制PHGDH表達(dá)可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖[16]。此外，本研究通過EdU 細(xì)胞增殖檢測發(fā)現(xiàn)，抑制PHGDH表達(dá)可顯著減少處在增殖期的肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞比例。由此推測，PHGDH基因可能對雞肌肉細(xì)胞的增殖起正調(diào)控作用，可能是不同飼養(yǎng)模式影響肌肉生長發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵基因。

本研究還發(fā)現(xiàn)在骨骼肌細(xì)胞分化期間，PHGDH的表達(dá)量逐漸降低，這表明PHGDH可能在雞骨骼肌細(xì)胞分化過程中起到負(fù)調(diào)控作用。而PHGDH在分化第2 天出現(xiàn)的高表達(dá)現(xiàn)象可能是由于在本分化模型前期大部分雞骨骼肌細(xì)胞仍短時(shí)處于增殖狀態(tài)。綜上，本研究下一步將主要側(cè)重于對PHGDH在雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化過程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探究。

4 結(jié) 論

本研究基于RNA-seq 技術(shù)，對不同飼養(yǎng)模式下的肉雞腿肌進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序和分析，發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)與肌肉發(fā)育代謝相關(guān)的關(guān)鍵差異基因（ASNS、JPH2、PHGDH），且均在平養(yǎng)模式雞腿肌肌肉中高表達(dá)；對PHGDH基因在肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)的不同時(shí)期進(jìn)行表達(dá)譜檢測分析，以及結(jié)合抑制PHGDH表達(dá)的EdU 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)PHGDH基因可能在肉雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用，PHGDH基因可能是飼養(yǎng)模式影響肉雞肌肉發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵基因。