曾偉丹，趙冰茹，范 雪，楚高潔，徐新明，付雪峰，黃錫霞*，田可川*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，新疆烏魯木齊 830000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

表觀遺傳學(xué)是指DNA 序列不發(fā)生改變，而基因表達(dá)發(fā)生可遺傳變化，最終導(dǎo)致基因的功能或個(gè)體的表型發(fā)生變化。表觀遺傳修飾主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 的調(diào)節(jié)以及染色質(zhì)重塑[1-2]。DNA 甲基化作為主要的表觀遺傳修飾，是由S 腺苷甲硫氨酸（SAM）在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的作用下共價(jià)連接甲基和胞嘧啶的過(guò)程[3]，可介導(dǎo)生物過(guò)程如基因表達(dá)[4]、基因組印記[5]、細(xì)胞分化[6]和腫瘤形成[7]等，繼而發(fā)揮重要作用。根據(jù)前人文獻(xiàn)報(bào)道，已在哺乳動(dòng)物中鑒定出5 種DNMT，包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b 和DNMT3L[8]，它 們?cè)? 個(gè)不同的甲基化過(guò)程中起作用，即維持和從頭甲基化。DNMT1 主要參與維持甲基化，在DNA 復(fù)制后優(yōu)先將甲基轉(zhuǎn)移至半甲基化DNA 鏈。DNMT3a 和DNMT3b 參與從頭甲基化活性，均在未修飾的胞嘧啶殘基的甲基化中起作用。DNMTs通過(guò)調(diào)節(jié)基因的DNA甲基化水平進(jìn)而影響該基因的表達(dá)，如抑制克隆胚胎中DNMT1的表達(dá)水平，可降低多能基因甲基化水平和促進(jìn)該基因的表達(dá)[9]。在絨山羊毛囊發(fā)育相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，DNMTs通過(guò)調(diào)節(jié)Hoxc13基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)而調(diào)控該基因的mRNA 表達(dá)，參與山羊絨周期性生長(zhǎng)的過(guò)程[10]。Zhang 等[11]分析發(fā)現(xiàn)，高繁殖力綿羊組中DNMT1和DNMT3a的表達(dá)水平顯著低于低繁殖力組，表明DNMTs可能調(diào)控與綿羊繁殖力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在敲除小鼠模型實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎期敲除任何一種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶基因（DNMTl、DNMT3a、DNMT3b）都會(huì)導(dǎo)致其在胚胎或者圍產(chǎn)期致死[12]。可見(jiàn)，DNMTs在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。

蘇博美利奴羊是我國(guó)主要的超細(xì)型細(xì)毛羊品種之一，該品種的羊毛細(xì)度可達(dá)17～18 μm，具有產(chǎn)毛量高且毛品質(zhì)較好等特點(diǎn)[13]。毛囊作為產(chǎn)毛組織，其結(jié)構(gòu)特征直接影響羊毛產(chǎn)量和毛品質(zhì)[14]。因此，了解毛囊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并進(jìn)一步從分子水平解析毛囊生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)了DNMTs基因在蘇博美利奴羊毛囊發(fā)育6 個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況，以期為從DNA 甲基化水平解析不同時(shí)期毛囊發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物蘇博美利奴羊來(lái)自新疆科創(chuàng)繁育中心。選取2～3 歲經(jīng)產(chǎn)母羊，同期發(fā)情并使用同一種公羊精液進(jìn)行配種，統(tǒng)一條件下飼養(yǎng)管理。采集胚胎期65 d、85 d、105 d、135 d 和出生后7 d、30 d（分別記為G1、G2、G3、G4、G5、G6）胎兒的皮膚組織，每個(gè)時(shí)期均采集3 只羔羊。樣品采集處理后迅速放進(jìn)凍存管中，在液氮中保存用于提取總RNA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 使用Trizol（Invitrogen）試劑分離總RNA 并溶解于無(wú)RNase 水中，使用Nanodrop 2000 核酸檢測(cè)儀進(jìn)行RNA 濃度測(cè)定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行cDNA 合成，保存于-20℃冰箱內(nèi)。

1.2.2 候選基因引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 提供的綿羊DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因序列，內(nèi)參基因采用GAPDH，利用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行定量引物設(shè)計(jì)（表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 以cDNA 作為模板，進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增（總體系為25 μL）：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq（1×)，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA1 μL，ddH2O 10.5 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 15min，95℃ 10s，60℃ 30s，39 個(gè)循環(huán)；以0.5℃/s 的速度從65℃升高到95℃。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀上完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 用2-△△Ct法對(duì)6 個(gè)時(shí)期目的基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，利用SPSS19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮膚組織的總RNA 檢測(cè) 用1% 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)總RNA 進(jìn)行檢測(cè)，28 s 和18 s 兩條帶清晰可見(jiàn)且完整性較好（圖1），可用于反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PCR 產(chǎn)物檢測(cè) 以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，GAPDH引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物片段大小為113 bp，與預(yù)期片段大小一致（圖2），說(shuō)明引物特異性良好，反轉(zhuǎn)錄的cDNA 可以用于后續(xù)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)操作。

2.3DNMTs在蘇博美利奴羊毛囊發(fā)育不同時(shí)期皮膚中的表達(dá)分析 如表2 所示，蘇博美利奴羊在6 個(gè)毛囊發(fā)育時(shí)期DNMTs在皮膚中均有表達(dá)。DNMT1基因在G1時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于G2、G3 時(shí)期，顯著高于G4、G5、G6 時(shí)期。

DNMT3a基因表達(dá)的變化為先上升后下降，即從G1 時(shí)期開(kāi)始緩慢升高，在G3 時(shí)期達(dá)到最高，隨后下降；該基因的表達(dá)量在G1、G2、G3 時(shí)期極顯著高于G5、G6 時(shí)期，G1、G3 時(shí)期的表達(dá)量顯著高于G4 時(shí)期。

隨著毛囊發(fā)育時(shí)間的增加，在皮膚組織中DNMT3b呈時(shí)序性表達(dá)模式，即逐漸下降的趨勢(shì)。該基因在G1 時(shí)期的表達(dá)量顯著高于G6 時(shí)期，G2、G3、G4、G5、G6 時(shí)期之間的表達(dá)量差異不顯著。在相同時(shí)期的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b3 個(gè)基因之間的相對(duì)表達(dá)量水平差異不顯著。

表2 蘇博美利奴羊皮膚組織中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平及差異分析

3 討 論

毛囊中大概存活著20 種細(xì)胞，是一種獨(dú)特且復(fù)雜的控毛生長(zhǎng)微型器官，這些細(xì)胞在毛囊中共同參與皮膚中毛囊形態(tài)變化和周期性生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)[15]。本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)蘇博美利奴羊毛囊的組織形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期65 d 時(shí)初級(jí)毛囊開(kāi)始形成，胚胎期85 d 時(shí)由初級(jí)毛囊膨大部形成次級(jí)毛囊的毛芽，胚胎期105 d 時(shí)次級(jí)毛囊大量形成且分化出再分化次級(jí)毛囊，胚胎期135 d 時(shí)大多數(shù)初級(jí)毛囊和部分次級(jí)毛囊成熟[16]。

DNA 甲基化是內(nèi)源性修飾之一，通常情況下，DNA 甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，基因的高甲基化表現(xiàn)出低表達(dá)水平，而低甲基化基因表現(xiàn)出高表達(dá)水平。在這個(gè)過(guò)程中，DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）發(fā)揮著到關(guān)鍵作用。DNMT1、DNMT3a、DNMT3b作為DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶基因家族的主要基因，可以共同參與調(diào)控目的基因甲基化[17-18]。Guo 等[19]通過(guò)檢測(cè)牛肌肉和肝臟中DNMT3a和DNMT3b表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)水平可能影響脂肪沉積相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響肉牛的肉質(zhì)。將DNMT1基因鈍化的角質(zhì)化細(xì)胞移植到免疫缺陷鼠后，造成了小鼠表皮發(fā)育不良，同時(shí)伴隨增殖相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)[20]。吳江鴻等[21]提出控制毛發(fā)季節(jié)性生長(zhǎng)的分子機(jī)理假說(shuō)，即光照長(zhǎng)短影響褪黑激素的分泌，而褪黑激素含量增加會(huì)導(dǎo)致甲基化轉(zhuǎn)移酶作用減弱而降低甲基化水平，毛囊發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量增加，進(jìn)而調(diào)控毛發(fā)組成蛋白表達(dá)。這些研究結(jié)果均提示DNMTs可能參與調(diào)控目的基因甲基化進(jìn)而影響基因的表達(dá)水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1基因在蘇博美利奴羊皮膚組織G2～G6 時(shí)期呈上升趨勢(shì)且在G1 時(shí)期表達(dá)量最高，可能與DNMT1在毛乳頭細(xì)胞增殖過(guò)程中起著維持作用有關(guān)，參與調(diào)控初級(jí)毛囊毛芽前體形成。DNMT3a及DNMT3b在G4 時(shí)期之前均有相對(duì)較高的表達(dá)，該時(shí)期之后均呈下降趨勢(shì)。G1～G3 時(shí)期是初級(jí)毛囊及部分次級(jí)毛囊發(fā)育階段，在G4 時(shí)期初級(jí)及次級(jí)毛囊基本達(dá)到成熟狀態(tài)，結(jié)合蘇博美利奴羊毛囊周期性變化的形態(tài)特征[16]推測(cè)DNMTs對(duì)參與毛囊內(nèi)細(xì)胞的增殖和分化具有重要作用，且主要作用于初級(jí)和次級(jí)毛囊的發(fā)育時(shí)期。

在K14 介導(dǎo)的DNMT1敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1參與調(diào)節(jié)DNA 甲基化，維持毛囊周期的穩(wěn)態(tài)[22]。DNMT1 是主要的維持甲基化狀態(tài)的酶。DNMT1普遍存在于人體細(xì)胞中，在增殖細(xì)胞中表達(dá)很高，并且和DNA 的復(fù)制位點(diǎn)關(guān)系密切[23]。本研究中DNMT1在整個(gè)毛囊發(fā)育時(shí)期均有較高表達(dá)，表明DNMT1在毛囊發(fā)育過(guò)程發(fā)揮重要作用。DNMTs通常在胚胎發(fā)育早期有較高表達(dá)，調(diào)節(jié)DNA 甲基化狀態(tài)及基因的表達(dá)來(lái)參與細(xì)胞的發(fā)育和分化過(guò)程，當(dāng)胚胎發(fā)育到一定階段時(shí)其甲基化狀態(tài)也保持相對(duì)穩(wěn)定，DNMTs的表達(dá)逐漸減少[23]。熊小燕[24]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊妊娠早期DNMTs的相對(duì)表達(dá)較高，隨著妊娠時(shí)間增加，DNMT1的表達(dá)量逐漸上升，與本研究結(jié)果相似，即在毛囊發(fā)育前3 個(gè)時(shí)期，DNMT3a和DNMT3b基因的表達(dá)量均高于后3 個(gè)時(shí)期，且DNMT3a的表達(dá)量增加，DNMT3b的表達(dá)降低，推測(cè)DNMTs之間的表達(dá)與作用可能存在互相制衡關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中DNMTs在相同時(shí)期的表達(dá)量差異不顯著，這與馮帥帥[10]的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)在6 個(gè)時(shí)期DNMTs均有表達(dá)，說(shuō)明在毛囊發(fā)育過(guò)程中可能存在一定的調(diào)控作用，而DNMTs是否參與毛囊發(fā)育過(guò)程的DNA 甲基化，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，DNMTs基因在毛囊發(fā)育的6個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，并且在G1 時(shí)期的表達(dá)量顯著高于G6 時(shí)期，同一毛囊發(fā)育時(shí)期DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。