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        枯草芽孢桿菌的篩選及其與光合細菌復配對養(yǎng)殖水體的凈化

        2020-05-21 03:33:29劉珍珠樊振劉歡歡
        江蘇農(nóng)業(yè)科學 2020年6期
        關鍵詞:枯草芽孢氨氮

        劉珍珠 樊振 劉歡歡

        摘要:以光合細菌和枯草芽孢桿菌為試驗菌種,研究二者最優(yōu)濃度配比,應用在實際生產(chǎn)中提高降解水體氨氮、NO-2和化學需氧量(COD)濃度的能力。測定7種枯草芽孢桿菌的生長曲線,選取生長性能較好的菌株K1、K2、K3進行產(chǎn)酶活性檢測,篩選出菌株K3進行復配試驗,試驗設置1個對照組(CK)和7個復合菌組(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7),7個復合菌組(光合細菌 ∶ 枯草芽孢桿菌)的濃度配比分別為P1(1 ∶ 0)、P2(0 ∶ 1)、P3(1 ∶ 1)、P4(2 ∶ 1)、P5(3 ∶ 1)、P6(1 ∶ 2)、P7(1 ∶ 3),分析各試驗組的氨氮、NO-2和化學需氧量等水質(zhì)指標,選取處理結(jié)果最優(yōu)的復合菌組。結(jié)果表明,復合菌能夠明顯降低水體氨氮,其中P6降解能力最強,降解效果高于對照組4.9倍;能去除亞硝酸根濃度和水體中的化學需氧量。復合菌組的最佳濃度配比為1 ∶ 2,該濃度配比組較對照組和其他試驗組能夠明顯凈化養(yǎng)殖水質(zhì),有效提高凈化水質(zhì)能力。

        關鍵詞:光合細菌(Photosynthetic bacteria);枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);復合菌;養(yǎng)殖水體;凈化水質(zhì)

        中圖分類號: S182;X52? 文獻標志碼: A? 文章編號:1002-1302(2020)06-0164-04

        近年來隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,工業(yè)化的高密度養(yǎng)殖不斷擴大,與此同時,未處理養(yǎng)殖廢水和工業(yè)、生活污水的排放不僅使環(huán)境受到嚴重的污染,還影響人們的生活用水衛(wèi)生問題。養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到破壞,致使養(yǎng)殖業(yè)病害頻繁發(fā)生[1]。池塘自凈與調(diào)節(jié)能力并不能滿足清除殘餌、魚蝦排泄物等富營養(yǎng)因子的需要,養(yǎng)殖水體中氨氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、硫化物等嚴重超標,池塘水質(zhì)惡化,魚蝦病害頻頻發(fā)生[2]。為了解決上述問題,抗生素和各類化學藥劑在養(yǎng)殖池塘中大量而頻繁的施用,嚴重破壞了養(yǎng)殖環(huán)境的生物體系,不僅使養(yǎng)殖池塘的微生態(tài)失調(diào),而且使農(nóng)藥殘留超標,污染養(yǎng)殖水環(huán)境[3]。微生態(tài)制劑凈水以其高效率、低成本、見效快成為最有前景的凈水方法。目前應用的凈水微生態(tài)制劑主要種類有光合細菌、芽孢桿菌、硝化細菌和酵母菌等。光合細菌能夠改善水質(zhì),增加溶氧,降低氨氮,增加生產(chǎn)力[4]??莶菅挎邨U菌可以減少病害,降低氮磷,增加溶氧,增產(chǎn)增效[5-6]。兩者結(jié)合起來使用會產(chǎn)生不一樣的效果。有關光合細菌和芽孢桿菌協(xié)同凈化水質(zhì)的研究已有報道,羅勇勝等研究認為,光合細菌與枯草芽孢桿菌二者協(xié)同凈化作用效果較好[7];李君華等研究認為,二者協(xié)同作用能凈化水質(zhì),提高刺參免疫能力[8];姜海明等研究發(fā)現(xiàn),光合細菌和芽孢桿菌使用濃度比例為3 ∶ 1時,對烏鱧養(yǎng)殖水的氨氮和化學需氧量(COD)去除率最高[9]。因此,本研究擬通過對光合細菌和枯草芽孢桿菌2種菌設置不同濃度配比進行水質(zhì)指標檢測,來確定養(yǎng)殖水質(zhì)凈化作用的最優(yōu)配比,以期得到養(yǎng)殖生產(chǎn)中復合菌的最佳濃度配比。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 菌種與水體來源 試驗所用光合細菌為新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所生態(tài)實驗室保藏,枯草芽孢桿菌菌粉、養(yǎng)殖廢水由新疆昌吉天康畜牧科技有限公司提供。

        1.1.2 培養(yǎng)基 本試驗所使用的光合細菌培養(yǎng)基為RCVBN培養(yǎng)基。RCVBN培養(yǎng)基配方:乙酸鈉 3.00 g,丙酸鈉1.00 g,硫酸銨1.00 g,硫酸鎂 0.20 g,氯化鈉1.00 g,磷酸二氫鉀0.30 g,磷酸氫二鉀0.50 g,氯化鈣0.05 g,酵母膏0.10 g,微量元素1.00 mL,蒸餾水1 000 mL,pH值調(diào)至7.0。

        枯草芽孢桿菌活化、生長培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL。

        枯草芽孢桿菌活性檢測培養(yǎng)基。淀粉酶培養(yǎng)基:牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,可溶性淀粉 2 g,蒸餾水1 000 mL,pH值調(diào)至7.0~7.2,瓊脂粉20 g。蛋白酶培養(yǎng)基:葡萄糖1 g,酵母膏1 g,酪素 5 g,磷酸氫二鉀1 g,磷酸二氫鉀0.5 g,硫酸鎂 0.1 g,蒸餾水1 000 mL,pH值調(diào)至7.0~7.2,瓊脂粉20 g。纖維素酶培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉2 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 000 mL,pH值調(diào)至 7.2~7.4,瓊脂粉20 g。

        1.1.3 試驗儀器 單人雙面凈化工作臺(SW-CJ-1F),購自蘇州凈化設備有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-2102C),購自上海智城分析儀器制造有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250BF2),購自上海?,攲嶒炘O備有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9070),購自上海鴻都電子科技有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-75 SII),購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;電子天平(JW-B5003,0.001 g),購自諸暨市超澤衡器設備有限公司;調(diào)速型迷你離心機(Super Mini Dancer),購自生工生物工程(上海)股份有限公司;pH計(MT-5000),購自上海精密科學儀器有限公司;紫外分光光度計(UV-2550),購自日本島津自動化設備有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 生長性能良好的枯草芽孢桿菌篩選

        1.2.1.1 生長曲線的測定 將筆者所在實驗室選購的7種菌粉標記為K1、K2、K3、K4、K5、K6、K8,稱取0.1 g用無菌梯度稀釋法,稀釋涂布于LB培養(yǎng)基,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至長出明顯的單菌落,挑取單菌落于LB培養(yǎng)液中分別在20、25 ℃ 2種溫度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng),每2 h取樣測量1次菌液濃度,并觀察這7種枯草芽孢桿菌的生長情況。

        1.2.1.2 產(chǎn)酶活性的檢測 選取其中生長活性最好的枯草芽孢桿菌,用打孔法檢測其產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等3種酶的活性,分別在淀粉酶培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基和纖維素酶培養(yǎng)基上用打孔法將培養(yǎng)24 h后的枯草芽孢桿菌菌液用移液槍吸入孔中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察產(chǎn)酶圈。

        1.2.2 枯草芽孢桿菌和光合細菌的復配試驗

        1.2.2.1 復配菌的制備 將純化培養(yǎng)的2種菌按照比例配制,試驗設置1個對照組(不添加菌)和7個復配菌組,7個復配菌組(光合細菌 ∶ 枯草芽孢桿菌)濃度配比分別為P1(1 ∶ 0)、P2(0 ∶ 1)、P3(1 ∶ 1)、P4(2 ∶ 1)、P5(3 ∶ 1)、P6(1 ∶ 2)、P7(1 ∶ 3)。光合細菌活菌數(shù)為1.3×109 CFU/mL,枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為5.17×1011 CFU/g??莶菅挎邨U菌每份加菌量為0.002 5 g,光合細菌添加量每份為13 mL。

        1.2.2.2 實驗室模擬生物降解試驗設計 取塑料箱(0.5 m×0.4 m×0.5 m),每個加入養(yǎng)殖池塘水(稀釋豬糞水)13 L,復合菌劑投放量為50 mL(濃度3.85 mL/L),試驗組除對照外共有7組,每組2個平行。在室內(nèi)光照,溫度控制在30 ℃條件下培養(yǎng)并觀察。分析各試驗組的化學需氧量濃度(高錳酸鉀法)、氨氮含量(納氏試劑)、亞硝酸根含量等水質(zhì)指標。每隔1 d測定1次,連續(xù)測定8 d。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 枯草芽孢桿菌的篩選

        如圖1所示,在培養(yǎng)時間為26 h內(nèi),當培養(yǎng)溫度為20 ℃時,菌種K1的生長速率最快,在培養(yǎng)26 h時,菌液濃度最高;菌種K2的生長速率次之,其次是菌種K3。當培養(yǎng)溫度為25 ℃時,菌種K1、K2和K3的生長速率較快,菌液濃度較高。因此,選擇K1、K2和K3這3株菌進行產(chǎn)酶活性檢測。

        2.2 產(chǎn)酶活性能力檢測結(jié)果

        對K1、K2和K3這3株枯草芽孢桿菌進行產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性能力檢測,結(jié)果如表1所示,菌種K1產(chǎn)蛋白酶圈直徑為1.680 cm,產(chǎn)淀粉酶圈直徑為0.832 cm,產(chǎn)纖維素酶圈直徑為 0.000 cm;菌種K2產(chǎn)蛋白酶圈直徑為1.836 cm,產(chǎn)淀粉酶圈直徑為0.828 cm,產(chǎn)纖維素酶圈直徑為 0.000 cm;菌種K3產(chǎn)蛋白酶圈直徑為2.160 cm,產(chǎn)淀粉酶圈直徑為 1.236 cm,產(chǎn)纖維素酶圈直徑為 0.000 cm。菌株K3的產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶活性能力比菌種K1和K2強, 菌種K1和K2產(chǎn)蛋白酶與產(chǎn)淀粉酶的活性能力相當,3株菌的產(chǎn)纖維素酶活性能力都很弱,產(chǎn)纖維素酶圈直徑都為0.000 cm。因此選擇K3菌株與光合細菌進行復配。

        2.3 不同處理對NH+4降解效果的影響

        如圖2所示,CK(對照組)對NH+4濃度的降解趨勢最緩,最終結(jié)果與原始相差不大。而其他復合菌組對NH+4濃度的降解速率在前8 d均快于CK,其中P6組的降解速率比其他組快,P3和P7組降解速率為7組復合菌組中最慢。

        2.4 不同處理對NO-2降解效果的影響

        如圖3所示,CK的降解速率比復合菌組的慢,但是總體差異不明顯,各組對NO-2的降解速率差異不明顯。

        2.5 不同處理對COD降解效果的影響

        如圖4所示,CK的COD隨培養(yǎng)時間的延長呈上升趨勢,與復合菌組呈現(xiàn)差異明顯,P1與P7組對COD的降解能力較強。

        3 討論與結(jié)論

        本研究結(jié)果表明,光合細菌、枯草芽孢桿菌以及

        復合菌都能有效降低水體氨氮、化學需氧量和NO-2濃度的能力。光合細 菌 ∶ 芽 孢桿菌=1 ∶ 2(P6)時,對水中氨氮的降解效果最好,比對照組高出4.9倍,比單一光合細菌(P1)與單一枯草芽孢桿菌(P2)分別高出1.9、1.5倍,復合菌效果明顯優(yōu)于單一菌。因為養(yǎng)殖池塘水體中飼養(yǎng)魚類喂食的餌料較多,所以水體中的氨氮含量增加,氨氮容易引起水中藻類及其他微生物大量繁殖,形成富營養(yǎng)化污染,使水中溶解氧含量下降,魚類大量死亡,甚至會導致湖泊干涸。由于氨氮對養(yǎng)殖水體的危害較大,就不得不尋找其他方法來解決現(xiàn)存的高密度養(yǎng)殖后果。

        光合細菌 ∶ 芽孢桿菌=1 ∶ 2(P6)時,對水體中亞硝酸鹽降解效果最好,其降解率是CK組的1倍,但與其他復合菌組處理效果差異不明顯。養(yǎng)殖池塘由于大規(guī)模高密度的養(yǎng)殖,很容易造成水體缺氧,在厭氧狀態(tài)下,水體中的硝酸根離子還原成亞硝酸根離子,亞硝酸根離子大量積累,對養(yǎng)殖水體的環(huán)境與養(yǎng)殖動物造成嚴重危害。而光合細菌與芽孢桿菌對于水體中氨氮的去除能力較強,因此,在養(yǎng)殖池塘中添加微生態(tài)制劑是一種較好的解決方案。

        光合細菌 ∶ 芽孢桿菌=1 ∶ 3(P7)時,對水體中化學需氧量降解效果最好,在培養(yǎng)時間內(nèi),對照組的COD呈現(xiàn)上升趨勢,P7組對COD的降解明顯,降解效率高于單一組1.9倍。COD是評價水體質(zhì)量的重要指標,COD的高低在很大程度上反映水環(huán)境的有機污染或水體的清潔度[10]。光合細菌在厭氧條件下可以固定CO2,也可以利用低級脂肪酸、氨基酸等作為碳源進而降低COD[10]。芽孢桿菌是具有高活性消化酶系的異養(yǎng)菌,能迅速將養(yǎng)殖水體中的有機物分解為小分子有機酸、氨基酸及氨,從而降低COD。2種細菌都具有降解有機物的能力,二者存在共生關系[11-12]。P7組中復合菌濃度比例取得最好的COD降解效果,說明兩者共生達到平衡,都能夠發(fā)揮各自的有機物降解能力,達到最佳降低COD的效果。

        微生態(tài)制劑的使用不但提高了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中降解有機污染的能力,還大大節(jié)省了養(yǎng)殖成本,其中光合細菌既能發(fā)揮高效的降解作用,利用水體中有毒的胺、H2S等,還能分泌一些對養(yǎng)殖動物有益的活性物質(zhì)[13]。枯草芽孢桿菌除了可以限制養(yǎng)殖水體中有害菌的生存和繁殖,養(yǎng)殖動物食用后可改善體內(nèi)生態(tài)環(huán)境,并對動物某些疾病有防治作用。復合菌的使用既可以使各類微生物都各自發(fā)揮優(yōu)勢,又能相互利用、取長補短,使利益最大化。

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