劉珍珠 樊振 劉歡歡

摘要：以光合細菌和枯草芽孢桿菌為試驗菌種，研究二者最優(yōu)濃度配比，應用在實際生產(chǎn)中提高降解水體氨氮、NO-2和化學需氧量（COD）濃度的能力。測定7種枯草芽孢桿菌的生長曲線，選取生長性能較好的菌株K1、K2、K3進行產(chǎn)酶活性檢測，篩選出菌株K3進行復配試驗，試驗設置1個對照組（CK）和7個復合菌組（P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7），7個復合菌組（光合細菌 ∶ 枯草芽孢桿菌）的濃度配比分別為P1（1 ∶ 0）、P2（0 ∶ 1）、P3（1 ∶ 1）、P4（2 ∶ 1）、P5（3 ∶ 1）、P6（1 ∶ 2）、P7（1 ∶ 3），分析各試驗組的氨氮、NO-2和化學需氧量等水質(zhì)指標，選取處理結(jié)果最優(yōu)的復合菌組。結(jié)果表明，復合菌能夠明顯降低水體氨氮，其中P6降解能力最強，降解效果高于對照組4.9倍;能去除亞硝酸根濃度和水體中的化學需氧量。復合菌組的最佳濃度配比為1 ∶ 2，該濃度配比組較對照組和其他試驗組能夠明顯凈化養(yǎng)殖水質(zhì)，有效提高凈化水質(zhì)能力。

關鍵詞：光合細菌（Photosynthetic bacteria）;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;復合菌;養(yǎng)殖水體;凈化水質(zhì)

中圖分類號： S182;X52? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0164-04

近年來隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，工業(yè)化的高密度養(yǎng)殖不斷擴大，與此同時，未處理養(yǎng)殖廢水和工業(yè)、生活污水的排放不僅使環(huán)境受到嚴重的污染，還影響人們的生活用水衛(wèi)生問題。養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到破壞，致使養(yǎng)殖業(yè)病害頻繁發(fā)生[1]。池塘自凈與調(diào)節(jié)能力并不能滿足清除殘餌、魚蝦排泄物等富營養(yǎng)因子的需要，養(yǎng)殖水體中氨氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、硫化物等嚴重超標，池塘水質(zhì)惡化，魚蝦病害頻頻發(fā)生[2]。為了解決上述問題，抗生素和各類化學藥劑在養(yǎng)殖池塘中大量而頻繁的施用，嚴重破壞了養(yǎng)殖環(huán)境的生物體系，不僅使養(yǎng)殖池塘的微生態(tài)失調(diào)，而且使農(nóng)藥殘留超標，污染養(yǎng)殖水環(huán)境[3]。微生態(tài)制劑凈水以其高效率、低成本、見效快成為最有前景的凈水方法。目前應用的凈水微生態(tài)制劑主要種類有光合細菌、芽孢桿菌、硝化細菌和酵母菌等。光合細菌能夠改善水質(zhì)，增加溶氧，降低氨氮，增加生產(chǎn)力[4]?？莶菅挎邨U菌可以減少病害，降低氮磷，增加溶氧，增產(chǎn)增效[5-6]。兩者結(jié)合起來使用會產(chǎn)生不一樣的效果。有關光合細菌和芽孢桿菌協(xié)同凈化水質(zhì)的研究已有報道，羅勇勝等研究認為，光合細菌與枯草芽孢桿菌二者協(xié)同凈化作用效果較好[7];李君華等研究認為，二者協(xié)同作用能凈化水質(zhì)，提高刺參免疫能力[8];姜海明等研究發(fā)現(xiàn)，光合細菌和芽孢桿菌使用濃度比例為3 ∶ 1時，對烏鱧養(yǎng)殖水的氨氮和化學需氧量（COD）去除率最高[9]。因此，本研究擬通過對光合細菌和枯草芽孢桿菌2種菌設置不同濃度配比進行水質(zhì)指標檢測，來確定養(yǎng)殖水質(zhì)凈化作用的最優(yōu)配比，以期得到養(yǎng)殖生產(chǎn)中復合菌的最佳濃度配比。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與水體來源 試驗所用光合細菌為新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所生態(tài)實驗室保藏，枯草芽孢桿菌菌粉、養(yǎng)殖廢水由新疆昌吉天康畜牧科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 本試驗所使用的光合細菌培養(yǎng)基為RCVBN培養(yǎng)基。RCVBN培養(yǎng)基配方：乙酸鈉 3.00 g，丙酸鈉1.00 g，硫酸銨1.00 g，硫酸鎂 0.20 g，氯化鈉1.00 g，磷酸二氫鉀0.30 g，磷酸氫二鉀0.50 g，氯化鈣0.05 g，酵母膏0.10 g，微量元素1.00 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.0。

枯草芽孢桿菌活化、生長培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL。

枯草芽孢桿菌活性檢測培養(yǎng)基。淀粉酶培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉 2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.0～7.2，瓊脂粉20 g。蛋白酶培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母膏1 g，酪素 5 g，磷酸氫二鉀1 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.0～7.2，瓊脂粉20 g。纖維素酶培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉2 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至 7.2～7.4，瓊脂粉20 g。

1.1.3 試驗儀器 單人雙面凈化工作臺（SW-CJ-1F），購自蘇州凈化設備有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-2102C），購自上海智城分析儀器制造有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱（SPX-250BF2），購自上海?，攲嶒炘O備有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070），購自上海鴻都電子科技有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-75 SII），購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;電子天平（JW-B5003，0.001 g），購自諸暨市超澤衡器設備有限公司;調(diào)速型迷你離心機（Super Mini Dancer），購自生工生物工程（上海）股份有限公司;pH計（MT-5000），購自上海精密科學儀器有限公司;紫外分光光度計（UV-2550），購自日本島津自動化設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長性能良好的枯草芽孢桿菌篩選

1.2.1.1 生長曲線的測定 將筆者所在實驗室選購的7種菌粉標記為K1、K2、K3、K4、K5、K6、K8，稱取0.1 g用無菌梯度稀釋法，稀釋涂布于LB培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長出明顯的單菌落，挑取單菌落于LB培養(yǎng)液中分別在20、25 ℃ 2種溫度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，每2 h取樣測量1次菌液濃度，并觀察這7種枯草芽孢桿菌的生長情況。

1.2.1.2 產(chǎn)酶活性的檢測 選取其中生長活性最好的枯草芽孢桿菌，用打孔法檢測其產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等3種酶的活性，分別在淀粉酶培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基和纖維素酶培養(yǎng)基上用打孔法將培養(yǎng)24 h后的枯草芽孢桿菌菌液用移液槍吸入孔中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察產(chǎn)酶圈。

1.2.2 枯草芽孢桿菌和光合細菌的復配試驗

1.2.2.1 復配菌的制備 將純化培養(yǎng)的2種菌按照比例配制，試驗設置1個對照組（不添加菌）和7個復配菌組，7個復配菌組（光合細菌 ∶ 枯草芽孢桿菌）濃度配比分別為P1（1 ∶ 0）、P2（0 ∶ 1）、P3（1 ∶ 1）、P4（2 ∶ 1）、P5（3 ∶ 1）、P6（1 ∶ 2）、P7（1 ∶ 3）。光合細菌活菌數(shù)為1.3×109 CFU/mL，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為5.17×1011 CFU/g?？莶菅挎邨U菌每份加菌量為0.002 5 g，光合細菌添加量每份為13 mL。

1.2.2.2 實驗室模擬生物降解試驗設計 取塑料箱（0.5 m×0.4 m×0.5 m），每個加入養(yǎng)殖池塘水（稀釋豬糞水）13 L，復合菌劑投放量為50 mL（濃度3.85 mL/L），試驗組除對照外共有7組，每組2個平行。在室內(nèi)光照，溫度控制在30 ℃條件下培養(yǎng)并觀察。分析各試驗組的化學需氧量濃度（高錳酸鉀法）、氨氮含量（納氏試劑）、亞硝酸根含量等水質(zhì)指標。每隔1 d測定1次，連續(xù)測定8 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的篩選

如圖1所示，在培養(yǎng)時間為26 h內(nèi)，當培養(yǎng)溫度為20 ℃時，菌種K1的生長速率最快，在培養(yǎng)26 h時，菌液濃度最高;菌種K2的生長速率次之，其次是菌種K3。當培養(yǎng)溫度為25 ℃時，菌種K1、K2和K3的生長速率較快，菌液濃度較高。因此，選擇K1、K2和K3這3株菌進行產(chǎn)酶活性檢測。

2.2 產(chǎn)酶活性能力檢測結(jié)果

對K1、K2和K3這3株枯草芽孢桿菌進行產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性能力檢測，結(jié)果如表1所示，菌種K1產(chǎn)蛋白酶圈直徑為1.680 cm，產(chǎn)淀粉酶圈直徑為0.832 cm，產(chǎn)纖維素酶圈直徑為 0.000 cm;菌種K2產(chǎn)蛋白酶圈直徑為1.836 cm，產(chǎn)淀粉酶圈直徑為0.828 cm，產(chǎn)纖維素酶圈直徑為 0.000 cm;菌種K3產(chǎn)蛋白酶圈直徑為2.160 cm，產(chǎn)淀粉酶圈直徑為 1.236 cm，產(chǎn)纖維素酶圈直徑為 0.000 cm。菌株K3的產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶活性能力比菌種K1和K2強， 菌種K1和K2產(chǎn)蛋白酶與產(chǎn)淀粉酶的活性能力相當，3株菌的產(chǎn)纖維素酶活性能力都很弱，產(chǎn)纖維素酶圈直徑都為0.000 cm。因此選擇K3菌株與光合細菌進行復配。

2.3 不同處理對NH+4降解效果的影響

如圖2所示，CK（對照組）對NH+4濃度的降解趨勢最緩，最終結(jié)果與原始相差不大。而其他復合菌組對NH+4濃度的降解速率在前8 d均快于CK，其中P6組的降解速率比其他組快，P3和P7組降解速率為7組復合菌組中最慢。

2.4 不同處理對NO-2降解效果的影響

如圖3所示，CK的降解速率比復合菌組的慢，但是總體差異不明顯，各組對NO-2的降解速率差異不明顯。

2.5 不同處理對COD降解效果的影響

如圖4所示，CK的COD隨培養(yǎng)時間的延長呈上升趨勢，與復合菌組呈現(xiàn)差異明顯，P1與P7組對COD的降解能力較強。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，光合細菌、枯草芽孢桿菌以及

復合菌都能有效降低水體氨氮、化學需氧量和NO-2濃度的能力。光合細 菌 ∶ 芽 孢桿菌=1 ∶ 2（P6）時，對水中氨氮的降解效果最好，比對照組高出4.9倍，比單一光合細菌（P1）與單一枯草芽孢桿菌（P2）分別高出1.9、1.5倍，復合菌效果明顯優(yōu)于單一菌。因為養(yǎng)殖池塘水體中飼養(yǎng)魚類喂食的餌料較多，所以水體中的氨氮含量增加，氨氮容易引起水中藻類及其他微生物大量繁殖，形成富營養(yǎng)化污染，使水中溶解氧含量下降，魚類大量死亡，甚至會導致湖泊干涸。由于氨氮對養(yǎng)殖水體的危害較大，就不得不尋找其他方法來解決現(xiàn)存的高密度養(yǎng)殖后果。

光合細菌 ∶ 芽孢桿菌=1 ∶ 2（P6）時，對水體中亞硝酸鹽降解效果最好，其降解率是CK組的1倍，但與其他復合菌組處理效果差異不明顯。養(yǎng)殖池塘由于大規(guī)模高密度的養(yǎng)殖，很容易造成水體缺氧，在厭氧狀態(tài)下，水體中的硝酸根離子還原成亞硝酸根離子，亞硝酸根離子大量積累，對養(yǎng)殖水體的環(huán)境與養(yǎng)殖動物造成嚴重危害。而光合細菌與芽孢桿菌對于水體中氨氮的去除能力較強，因此，在養(yǎng)殖池塘中添加微生態(tài)制劑是一種較好的解決方案。

光合細菌 ∶ 芽孢桿菌=1 ∶ 3（P7）時，對水體中化學需氧量降解效果最好，在培養(yǎng)時間內(nèi)，對照組的COD呈現(xiàn)上升趨勢，P7組對COD的降解明顯，降解效率高于單一組1.9倍。COD是評價水體質(zhì)量的重要指標，COD的高低在很大程度上反映水環(huán)境的有機污染或水體的清潔度[10]。光合細菌在厭氧條件下可以固定CO2，也可以利用低級脂肪酸、氨基酸等作為碳源進而降低COD[10]。芽孢桿菌是具有高活性消化酶系的異養(yǎng)菌，能迅速將養(yǎng)殖水體中的有機物分解為小分子有機酸、氨基酸及氨，從而降低COD。2種細菌都具有降解有機物的能力，二者存在共生關系[11-12]。P7組中復合菌濃度比例取得最好的COD降解效果，說明兩者共生達到平衡，都能夠發(fā)揮各自的有機物降解能力，達到最佳降低COD的效果。

微生態(tài)制劑的使用不但提高了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中降解有機污染的能力，還大大節(jié)省了養(yǎng)殖成本，其中光合細菌既能發(fā)揮高效的降解作用，利用水體中有毒的胺、H2S等，還能分泌一些對養(yǎng)殖動物有益的活性物質(zhì)[13]。枯草芽孢桿菌除了可以限制養(yǎng)殖水體中有害菌的生存和繁殖，養(yǎng)殖動物食用后可改善體內(nèi)生態(tài)環(huán)境，并對動物某些疾病有防治作用。復合菌的使用既可以使各類微生物都各自發(fā)揮優(yōu)勢，又能相互利用、取長補短，使利益最大化。

參考文獻：

[1]孫德文，詹 勇，許梓榮. 微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用[J]. 淡水漁業(yè)，2002，32（3）：54-57.

[2]王興禮，葉志慧. 魚類健康養(yǎng)殖的技術(shù)措施[J]. 內(nèi)陸水產(chǎn)，2008，33（6）：8-9.

[3]李南充. 微生態(tài)制劑在池塘養(yǎng)殖中的應用研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2013.

[4]謝德兵，朱思華，谷 融，等. 光合細菌在鱖魚養(yǎng)殖中應用效果[J]. 科技創(chuàng)業(yè)月刊，2017，30（5）：117-119.

[5]Wang Y B，Xu Z R，Xia M S. The effectiveness of commercial probiotics in northern white shrimp Penaeus vannamei ponds[J]. Fisheries Science，2005，71（5）：1036-1041.

[6]張克強，李 野，李軍幸. 芽孢桿菌菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用初探[J]. 海洋科學，2006，30（9）：88-91.

[7]羅勇勝，李卓佳，楊鶯鶯，等. 光合細菌與芽孢桿菌協(xié)同凈化養(yǎng)殖水體的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2006，25（增刊1）：206-210.

[8]李君華，劉佳亮，曹學彬，等. 芽孢桿菌與光合細菌協(xié)同作用對養(yǎng)殖刺參的影響[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化，2013，40（1）：7-12.

[9]姜海明，楊騰騰，馮 磊，等. 芽孢桿菌與光合細菌對烏鱧養(yǎng)殖水的凈化作用研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2010，49（6）：1428-1430.

[10]柯細勇，康 旭，趙志偉，等. 水質(zhì)指標COD的優(yōu)缺點及其測量方法發(fā)展[J]. 環(huán)境科學與技術(shù)，2011，34（6）：255-258.

[11]杭小英，葉雪平，施偉達，等. 枯草芽孢桿菌制劑對羅氏沼蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的影響[J]. 浙江海洋學院學報（自然科學版），2008，27（2）：197-200.

[12]湯保貴，徐中文，張金燕，等. 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件及對水質(zhì)的凈化作用[J]. 淡水漁業(yè)，2007，37（3）：45-48.

[13]何若天，何勇強，農(nóng)友業(yè). 農(nóng)用益生菌生產(chǎn)與應用手冊[M]. 北京：金盾出版社，2015：35-124.姚晶晶，陳麗君，王明銳，等. 西瓜中殺線蟲劑農(nóng)藥殘留及風險評估[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（6）：168-172.