路強(qiáng)強(qiáng) 趙葉子 陳智坤

摘要：采用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水解透明圈法、濾紙條崩解法、酶活力比較法、枯莖降解失重法，研究13種常用的纖維素降解菌菌株和5個(gè)組合菌系對(duì)纖維素的降解效率，結(jié)果表明，模式菌種白腐菌（F-6）對(duì)CMC-Na具有非常好的降解作用，且產(chǎn)酶活性顯著高于其他12種單一菌株（P<0.05）;與未接種菌系（株）相比，組合菌系的濾紙條崩解速率有明顯提高;由“鏈霉菌屬A-1+潮濕纖維單胞菌B-3+熱帶假絲酵母F-5+白腐菌F-6”構(gòu)建的菌系JX-1產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶、外切酶、苷酶活性分別為25.12、14.41、18.54 U/mL，顯著高于其他4個(gè)菌系，恒溫培養(yǎng)5、10、15 d時(shí)的枯莖降解失重率分別較白腐菌顯著提高151.94%、73.21%、67.49%，菌系JX-1為園林廢棄物堆腐發(fā)酵實(shí)現(xiàn)纖維素高效降解的最佳微生物組合。

關(guān)鍵詞：園林廢棄物;纖維素;降解;酶活;白腐菌;微生物菌系

中圖分類號(hào)：S182?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）06-0272-06

近年來，隨著美麗中國理念的深化和生態(tài)城市建設(shè)規(guī)模的擴(kuò)張，我國城市綠化水平、整體綠量均得到不斷提高，同時(shí)也產(chǎn)生了大量園林綠化廢棄物。城市園林廢棄物主要是指在城市綠地、行道樹及城郊林地中綠化植物自然或養(yǎng)護(hù)過程中產(chǎn)生的草坪、枯枝落葉及林木修剪物等，含有大量的淀粉、纖維素、木質(zhì)素和營養(yǎng)元素，是一種可再利用的有機(jī)資源，也是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的重要組成部分[1-2]。然而，作為城市固體垃圾的主要來源，每年有近 5 000 萬t的園林廢棄物進(jìn)入環(huán)衛(wèi)填埋系統(tǒng)，這不僅造成園林生物質(zhì)資源浪費(fèi)和垃圾填埋場(chǎng)收納能力的下降，也易導(dǎo)致周圍水體、大氣和土壤環(huán)境的二次污染。

目前，關(guān)于城市園林廢棄物的資源化利用主要是就地粉碎作為綠化土壤覆蓋物或簡(jiǎn)易堆肥作為植物生長基質(zhì)，但存在粉碎時(shí)易產(chǎn)生揚(yáng)塵、堆腐不透徹時(shí)易孳生病菌和臭氣等問題[3-4]。經(jīng)過一定預(yù)處理，在適宜條件下利用好氧微生物進(jìn)行堆肥發(fā)酵，以促進(jìn)大分子有機(jī)物降解和腐殖質(zhì)類物質(zhì)形成，這是實(shí)現(xiàn)園林綠化廢棄物資源化、高效化利用的主要途徑[5-7]，而構(gòu)建快速降解、徹底腐熟的微生物菌系是促進(jìn)大分子物質(zhì)分解、轉(zhuǎn)化及合成土壤有機(jī)質(zhì)、植物生長營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵[8-10]。有研究表明，纖維素酶主要包括葡聚糖內(nèi)切酶、外切酶、苷酶，是催化纖維素快速水解、誘導(dǎo)木質(zhì)素降解酶（胞外過氧化酶、胞外酚氧化酶）產(chǎn)生的核心酶系，它們協(xié)同作用可將纖維素水解、降解為纖維低聚糖及葡萄糖[11-17];而產(chǎn)纖維素酶的微生物菌系組合與劑量差異在很大程度上影響堆肥過程中堆體的升溫速率和腐熟徹底性[18-19]。

本研究結(jié)合菌間拮抗關(guān)系，采用羧甲基纖維素鈉水解透明圈法、濾紙條崩解法、酶活力比較法及枯莖降解失重法，對(duì)微生物肥料中常用的13種纖維素降解菌進(jìn)行單一菌株篩選和組合菌系復(fù)配，以期獲得高效降解園林廢棄物中纖維素的復(fù)合微生物菌系，為城市園林綠化廢棄物的資源化處置與高效化利用提供參考依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 降解纖維素常用的13種功能菌株（表1）由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心、中國普通微生物菌種保藏管理中心、陜西省科學(xué)院土壤資源與生物技術(shù)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、陜西省微生物研究所提供，經(jīng)陜西省微生物研究所孫曉宇副研究員菌間拮抗關(guān)系鑒定，表明菌株相互間無拮抗關(guān)系、無抑制孢子產(chǎn)生作用。

1.1.2 菌株培養(yǎng)及發(fā)酵 細(xì)菌采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NA）發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基組分為：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為 7.0～7.2;發(fā)酵條件為：裝液量50 mL/250 mL三角瓶，培養(yǎng)溫度32 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間24 h。

真菌采用馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基組分為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然;發(fā)酵條件為：裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

放線菌采用馬鈴薯改良培養(yǎng)基（PDA+）發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基組分為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂2 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然;發(fā)酵條件為：裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

1.1.3 菌系組合與發(fā)酵 在單株初篩的基礎(chǔ)上，選擇降解纖維素效率較高的菌株組合成5個(gè)菌系，每組菌系至少包含細(xì)菌、真菌、放線菌各1株（表2），由于白腐菌為降解纖維素的模式菌，設(shè)計(jì)每組菌系時(shí)均含有該菌株[20-22]。根據(jù)各菌種差異進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，再等體積比例混合。發(fā)酵條件為：液體裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為36～48 h。

1.1.4 菌種斜面和平板的制備 制備不同菌種斜面和平板時(shí)，在每1 000 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基中添加瓊脂15～20 g，經(jīng)高溫高壓濕熱滅菌，自然冷卻即可，滅菌溫度為121 ℃，滅菌時(shí)間為20 min。

1.2 微生物對(duì)纖維素降解效率的測(cè)定

1.2.1 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水解透明圈法測(cè)定 將各菌株直徑為1 cm的菌餅分別接種至CMC-Na平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～72 h，以不添加任何菌株作為空白對(duì)照（CK）;0.1%剛果紅水溶液浸染30 min，棄染液，用1 mol/L NaCl水溶液脫色1 h;分別測(cè)定菌落直徑（d）、水解透明圈直徑（D），單位為cm;計(jì)算CMC-Na水解透明圈的Dp值表示菌株降解纖維素的能力[23]，公式為：

Dp = （D/d）2。

1.2.2 濾紙條崩解法測(cè)定 各菌株采用相對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行三角瓶培養(yǎng)，以不添加任何菌株作為空白對(duì)照（CK）;每瓶中放置1 cm×6 cm 濾紙條3片，重復(fù)3次;每隔3 h觀察并記錄濾紙條崩解情況和時(shí)間[24]。

1.2.3 酶活力法測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[25-26]測(cè)定葡聚糖內(nèi)切酶、外切酶、苷酶活力，用1 mL酶底物反應(yīng)液1 min催化纖維素水解產(chǎn)生還原糖（葡萄糖）的量（μmol）反映微生物對(duì)纖維素的降解效率。測(cè)定內(nèi)切酶活力的處理方法為：取適量稀釋倍數(shù)的粗酶液0.5 mL，加入pH值為5.0的1% CMC-Na檸檬酸緩沖液1.5 mL，50 ℃恒溫水浴30 min;加入DNS試劑3 mL，煮沸5 min。測(cè)定外切酶活力的處理方法為：取適量稀釋倍數(shù)的粗酶液0.5 mL，加入pH值為5.0的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液1.5 mL、脫脂棉50 mg，50 ℃恒溫水浴60 min;加入DNS試劑3 mL，煮沸5 min。測(cè)定苷酶活力的處理方法為：取適量稀釋倍數(shù)的粗酶液0.5 mL，加入檸檬酸緩沖液1.5 mL、脫脂濾紙條50 mg，50 ℃恒溫水浴60 min;加入DNS試劑3 mL，煮沸5 min。處理液均采用TECAN Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀測(cè)定波長為540 nm處的吸光度值，以不添加任何菌株處理的作為空白對(duì)照（CK），并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線折算酶活。酶活計(jì)算公式為：

X=（A×N）/（V×T×M）。

式中：X表示纖維素酶活力，U/mL;A表示根據(jù)吸光度值在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的還原糖生成量，μg/mL;N表示粗酶液的稀釋倍數(shù);V表示加入酶液的體積，即為0.5 mL;T表示酶促反應(yīng)時(shí)間，內(nèi)切酶為30 min，外切酶和苷酶為60 min;M表示葡萄糖的分子質(zhì)量，為180。

1.2.4 枯莖降解失重率法測(cè)定 2017年11月，采集西安植物園水景區(qū)自然枯萎蘆葦[Phragmites australis （Cav.） Trin. ex Steu]的莖稈、枯葉、花穗，其基本物料有機(jī)質(zhì)、全碳、全氮含量分別為830.06、481.47、4.15 g/kg，碳氮比為116.02，pH值為7.8;風(fēng)干，并剪碎至1～2 cm細(xì)條，經(jīng)濕熱滅菌法滅殺雜菌及蟲卵;無菌水浸泡過夜，并沖洗可溶性有機(jī)物;105 ℃烘干，待用;稱取已處理的枯莖10 g、硫酸銨0.4 g、硫酸鎂0.1 g裝入250 mL三角瓶，每瓶加入pH值為7.0的5 mmol/L磷酸緩沖液30 mL、混合菌懸液6 mL，以加入6 mL蒸餾水為空白對(duì)照（CK）;混勻，50 ℃恒溫培養(yǎng)15 d;每菌系處理9組，并分別在恒溫培養(yǎng)5、10、15 d時(shí)觀察枯莖的降解情況，每次取3組，蒸餾水洗滌、過濾其降解物，剩余物105 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量未降解枯莖質(zhì)量，計(jì)算其降解失重率[27]。降解失重率計(jì)算公式為：

D=（Mp-Ms）/Mp×100%。

式中：D表示降解失重率，%;Mp表示降解前枯莖質(zhì)量，即為10 g;Ms表示未降解物質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與制圖，采用DPS 9.50軟件進(jìn)行差異性顯著分析，顯著性檢驗(yàn)采用最小顯著性差異檢驗(yàn)法（LSD法）（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌株對(duì)纖維素的降解效率

2.1.1 CMC-Na水解透明圈法測(cè)定 葡聚糖內(nèi)切酶對(duì)CMC-Na具有很強(qiáng)的水解能力，測(cè)定計(jì)算CMC-Na水解透明圈的Dp值，可反映不同菌株產(chǎn)內(nèi)切酶的活力水平，進(jìn)而可有效反映降解纖維素分子內(nèi)多聚糖的能力[28]。由表3可見，模式菌種白腐菌（F-6）對(duì)CMC-Na具有非常好的降解作用，其水解透明圈Dp值相對(duì)最高，達(dá)7.23;按照菌種的種屬類型，Dp值大小由高到低大致呈：真菌>放線菌>細(xì)菌;真菌F-3、F-2、F-5的Dp值相對(duì)偏高，分別為6.95、6.41、5.54，放線菌中菌株A-1的Dp值相對(duì)較高，為6.22，細(xì)菌中菌株B-3、B-4、B-2的Dp值相對(duì)較高，依次為5.37、4.43、3.49。

2.1.2 濾紙條崩解法測(cè)定 纖維素酶是具有纖維素降解能力酶的總稱，在相同培養(yǎng)條件下，不同微生物菌株對(duì)濾紙條的崩解速率差異可反映其產(chǎn)纖維素酶的生物代謝活力大小，從而進(jìn)一步可反映降解纖維素的能力。由表3可見，放線菌、細(xì)菌類菌株對(duì)濾紙條崩解所需時(shí)間相當(dāng)，為30 h左右，而真菌類所需時(shí)間相對(duì)長，約為36 h;放線菌中，菌種A-1的崩解時(shí)間相對(duì)最短，為29 h;細(xì)菌中，菌株B-3、B-2、B-4導(dǎo)致濾紙條崩解時(shí)間相對(duì)較短，分別為25、29、29 h;真菌中，菌株F-3、F-1、F-4、F-6崩解濾紙條的時(shí)間相對(duì)較短，分別為34、35、36、36 h。

2.1.3 酶活力法測(cè)定 葡聚糖內(nèi)切酶能在纖維素分子內(nèi)部任意裂解β-1，4糖苷鍵，而外切酶主要從纖維素分子的非還原端依次裂解β-1，4糖苷鍵，釋放纖維二糖分子。由表3可見，真菌菌株F-6、F-5、F-3的產(chǎn)內(nèi)切酶活性分別為21.51、19.78、7.35 U/mL，產(chǎn)外切酶活性分別為14.33、12.38、548 U/mL，顯著高于放線菌、細(xì)菌和其他真菌（P<0.05），真菌菌株F-6、F-5產(chǎn)苷酶活性分別為16.02、12.60 U/mL，顯著高于放線菌、細(xì)菌和其他真菌;放線菌中，菌株A-1產(chǎn)內(nèi)切酶、外切酶、苷酶活力相對(duì)較高，對(duì)應(yīng)各酶活性分別為5.04、4.00、6.03 U/mL;細(xì)菌中，各菌株產(chǎn)內(nèi)切酶活力相對(duì)較低，酶活性在1.36～1.73 U/mL之間，其中菌株B-3的產(chǎn)內(nèi)切酶活力相對(duì)最高，菌株B-3、B-2、B-1產(chǎn)外切酶和苷酶活力相對(duì)較高，酶活性分別為 2.84、2.72、2.19 U/mL和3.29、3.38、3.15 U/mL。

2.3 組合菌系對(duì)纖維素的降解效率

2.3.1 濾紙條崩解法測(cè)定 由表4可見，5個(gè)組合菌系在25～30 h內(nèi)可徹底崩解濾紙條，其中，JX-1的濾紙條崩解速率相對(duì)最快，崩解時(shí)間約為25 h。

2.3.2 酶活力法測(cè)定 由表4可見，組合菌系的產(chǎn)纖維素酶活力明顯高于單一菌株，相互間存在顯著性差異（P<0.05）;菌系JX-1、JX-2、JX-3產(chǎn)內(nèi)切酶活力相對(duì)較高，酶活性分別為25.12、22.23、20.52 U/mL，菌系JX-1、JX-2、JX-5產(chǎn)外切酶和苷酶活力相對(duì)較高，酶活性分別為14.41、14.07、13.64 U/mL和18.54、17.16、16.17 U/mL。

2.3.3 枯莖降解失重率法測(cè)定 測(cè)定枯莖降解失重率可真實(shí)反映微生物菌系對(duì)園林廢棄物的降解效率，體現(xiàn)菌系所產(chǎn)纖維素酶、木質(zhì)素酶及其他酶的活力水平。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在蘆葦枯莖混合液中接種5個(gè)組合菌系和單一菌株白腐菌（F-6）恒溫培養(yǎng)3 d時(shí)，蘆葦枯莖表面均不同程度地有白色菌絲散布生長;恒溫培養(yǎng)8 d時(shí)，菌落基本鋪滿枯莖表面，并呈棉絮狀。由圖1可知，恒溫培養(yǎng)5 d時(shí)，接種菌系 JX-1、JX-2、JX-5、JX-4的枯莖降解較菌系 JX-3、白腐菌顯著（P<0.05），失重率D值分別為16.15%、13.69%、12.98%、11.19%;恒溫培養(yǎng)10 d時(shí)，5個(gè)組合菌系枯莖降解失重率達(dá)20%左右，其中，失重率最高的為菌系JX-1，其失重率D值達(dá)21.11%，顯著高于其他處理;與接種F-6（白腐菌）的枯莖降解失重率相比，菌系JX-1恒溫培養(yǎng)5、10、15 d時(shí)的枯莖降解失重率分別顯著提高 151.94%、73.21%、67.49%;恒溫培養(yǎng)15 d時(shí)，與未接種菌株（CK）相比，接種各菌系的枯莖降解失重率有顯著提高，其中，接種JX-1、JX-5、JX-2的失重率D值相對(duì)較高，分別為33.37%、29.21%、28.87%。

3 結(jié)論與討論

纖維素是吡喃型D-葡萄糖殘基以β-1，4-糖苷鍵連接而成的復(fù)雜結(jié)晶分子，在適宜的發(fā)酵培養(yǎng)條件下可通過外源微生物代謝產(chǎn)酶作用，快速實(shí)現(xiàn)纖維素聚合物的裂解[29]。纖維素酶是一類能夠任意切斷β-1，4-糖苷鍵的酶總稱，是單一微生物自然代謝和復(fù)合微生物協(xié)同作用的產(chǎn)物，而接種富產(chǎn)纖維素酶的微生物是實(shí)現(xiàn)農(nóng)林廢棄物快速降解的有效手段[30]。然而，由于單一微生物存在產(chǎn)酶條件和酶類型的差異，導(dǎo)致動(dòng)態(tài)復(fù)合酶系不完善，從而對(duì)纖維素的降解速率產(chǎn)生影響。本研究通過單一微生物菌株的篩選和復(fù)合微生物菌系的構(gòu)建，旨在獲得園林廢棄物堆腐過程中多樣、高產(chǎn)纖維素酶的微生物菌群。

有研究表明，通過羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水解透明圈的出現(xiàn)時(shí)間可推測(cè)菌株產(chǎn)酶時(shí)間，水解透明圈Dp值大小可直觀反映菌株產(chǎn)酶能力和酶濃度;濾紙條崩解速率可反映菌株產(chǎn)酶的協(xié)同作用，而單一菌株的崩解時(shí)間與菌液在波長為600 nm生長曲線的吸光度峰值存在一致性[31];單一菌株酶活篩選過程中，透明圈Dp值、濾紙條崩解速率與菌株產(chǎn)酶能力、酶活力及酶間協(xié)同作用存在一定的正相關(guān)性[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）A-1菌株的水解透明圈Dp值為6.22，在試驗(yàn)放線菌中相對(duì)最大，濾紙條崩解速率約為29 h，相對(duì)最快，其產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶、外切酶、苷酶活性分別為 5.04、4.00、6.03 U/mL，也相對(duì)最高;潮濕纖維單胞菌B-3菌株的水解透明圈Dp值為5.73，在試驗(yàn)細(xì)菌中相對(duì)最大，濾紙條崩解時(shí)間約為25 h，崩解速率相對(duì)最快，其產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶、外切酶、苷酶活性分別為1.73、2.84、3.29 U/mL，也相對(duì)最高;白腐菌的水解透明圈Dp值為7.23，在試驗(yàn)真菌中相對(duì)最大，其濾紙條崩解速率約為36 h，并非最快，但其產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶、外切酶、苷酶活性分別為21.51、14.33、16.02 U/mL，顯著高于其他單一菌株（P<0.05）。

纖維素降解是多種酶協(xié)同作用的結(jié)果，單一菌株通常無法產(chǎn)生所有的纖維素酶，而組合菌系可實(shí)現(xiàn)酶類型的復(fù)合和酶活力的提升，同時(shí)可提高降解過程中微生物菌群類型與數(shù)量、縮短纖維素降解時(shí)間，并促進(jìn)難降解有機(jī)物的轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果表明，與單一菌株相比，5種組合菌系的產(chǎn)酶活性有明顯提高，與白腐菌相比，菌系JX-1、JX-2的產(chǎn)內(nèi)切酶活性分別較之提高16.8%、3.3%，產(chǎn)苷酶活性提高15.7%、7.1%，菌系JX-1、JX-2中均含有產(chǎn)酶活性相對(duì)較高的菌株A-1、F-5、F-6;含單一菌株相對(duì)最多的組合菌系JX-5，其產(chǎn)酶活性并非最高，甚至低于模式菌株白腐菌，這說明菌系產(chǎn)酶活性作用的發(fā)揮是多種酶有機(jī)協(xié)同的結(jié)果，而并非單一菌株酶活力的數(shù)量加和，而菌系中各菌株培養(yǎng)條件的差異對(duì)菌系酶活的影響、酶間的協(xié)同作用機(jī)理等有待深入研究;相對(duì)單一菌株，組合菌系的崩解速率有明顯提高，菌系JX-1與潮濕纖維單胞菌菌株B-3的崩解速率一致，崩解時(shí)間約為25 h，較熱帶假絲酵母菌株F-5崩解速率提高34.2%;各菌系對(duì)蘆葦枯莖的降解效率遠(yuǎn)高于白腐菌，菌系JX-1的降解效果相對(duì)最佳，恒溫培養(yǎng)5、10、15 d的枯莖降解失重率D值分別為16.15%、21.11%、33.37%，菌系JX-1、JX-2、JX-3、JX-4接種培養(yǎng)15 d時(shí)的枯莖降解失重率D值比白腐病菌株 F-6分別提高67.5%、44.9%、39.3%、46.7%。因此，由“鏈霉菌屬A-1+潮濕纖維單胞菌B-3+熱帶假絲酵母F-5+白腐菌F-6”構(gòu)建的菌系JX-1是促降解園林廢棄物中纖維素相對(duì)較好的微生物組合，可應(yīng)用于城市園林廢棄物的資源化處理。

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