蔣承順，李旺，柳艷，陸峰,*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

1 引言

DNA即脫氧核糖核酸，由脫氧核苷酸組成，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。每個(gè)脫氧核苷酸都由磷酸、脫氧核糖和含氮堿基組成。其中，含氮堿基又分為腺嘌呤A、鳥嘌呤G、胞嘧啶C和胸腺嘧啶T四種類型。四種含氮堿基含量與排列順序的不同決定了遺傳物質(zhì)的多樣性。作為大多數(shù)生物的遺傳信息載體，對(duì)DNA的研究一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

傳統(tǒng)的DNA分析方法，如聚合酶鏈反應(yīng)和微陣列技術(shù)，通常需要熒光標(biāo)記，不僅程序復(fù)雜、成本較高，還會(huì)導(dǎo)致DNA分子內(nèi)在化學(xué)結(jié)構(gòu)信息出現(xiàn)損失。而目前建立的檢測(cè)分析技術(shù)常涉及DNA標(biāo)靶的標(biāo)記和雜交后標(biāo)記，使檢測(cè)過程更加復(fù)雜[1,2,3]。表面增強(qiáng)拉曼光譜是一種超靈敏的檢測(cè)方法，當(dāng)分子與粗糙的貴金屬表面接近時(shí)，可產(chǎn)生強(qiáng)Raman散射信號(hào)[4,5]。許多學(xué)者運(yùn)用SERS對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)和分析。Papadopoulou[6,7]用硫醇化修飾DNA，使之附于金屬粒子表面，得到了增強(qiáng)的拉曼信號(hào)。而后發(fā)現(xiàn)在Ag膠基底中加入一定量的MgSO4能夠促進(jìn)Ag納米顆粒的聚集從而獲得DNA的SERS光譜，而不需要對(duì)DNA進(jìn)行硫醇化。2015年，Xu[8]等人用碘化鉀修飾Ag納米顆粒(Ag IMNPS)，同時(shí)添加MgSO4以中和表面電荷并增強(qiáng)DNA與Ag納米顆粒的相互作用，在模仿人生理環(huán)境的溶液中檢測(cè)到具有高度可重復(fù)性的拉曼信號(hào)。該方法操作簡(jiǎn)單，不需要特殊的基底，能檢測(cè)到豐富的信號(hào)且重現(xiàn)性較好。因此，本文以此方法為基礎(chǔ)，進(jìn)一步優(yōu)化SERS對(duì)ssDNA(single-stranded deoxyribonucleic Acid)的檢測(cè)條件。

已有的文獻(xiàn)研究中，SERS檢測(cè)ssDNA常使用大型且昂貴的臺(tái)式顯微共聚焦系統(tǒng)，有時(shí)不能滿足快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。相比之下，便攜式拉曼光譜系統(tǒng)具有易于攜帶、操作簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)格低的優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代分析中應(yīng)用越來越廣泛。然而，以Ag IMNPS為基礎(chǔ)的方法卻不直接適用于便攜式拉曼系統(tǒng)對(duì)DNA的檢測(cè)。因此，本文對(duì)該方法的檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，使其適用于便攜式拉曼光譜系統(tǒng)，并對(duì)優(yōu)化后的方法進(jìn)行穩(wěn)定性、重復(fù)性和檢測(cè)限的考察，還對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行峰位歸屬，為便攜式拉曼光譜系統(tǒng)檢測(cè)ssDNA提供一種新的方法基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 樣品與試劑

單鏈DNA GO18(序列為AACCTTTGGTCGGGCAAGGTAGGTT (5′～3′))，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；硝酸銀(AgNO3)、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O72H2O)、硝酸(HNO3)均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碘化鉀(KI)、硫酸鎂(MgSO4)均為分析純，購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司；其他實(shí)驗(yàn)耗材均購(gòu)于探索平臺(tái)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2.2 儀器與設(shè)備

便攜式拉曼光譜儀(BWS415-785H)，激光激發(fā)波長(zhǎng)785 nm，分辨率5 cm-1，配有放大倍數(shù)為20倍的物鏡，購(gòu)自美國(guó)必達(dá)泰克公司；雙光束紫外可見分光光度計(jì)(TU-1902)，購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高速離心機(jī)(TG16-WS)，購(gòu)自上海盧湘宜離心機(jī)有限公司；掃描電子顯微鏡(Zeiss EVO MA-10)，購(gòu)自德國(guó)Carl-Zeiss公司；多功能旋渦混合器(Vortex-Genie2)，購(gòu)自美國(guó)Scientific Industries 公司；實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)(Smart-D UV)，購(gòu)自上海和泰儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S)，購(gòu)自上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；電子天平，購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；圓底燒瓶，冷凝管等。

2.3 納米銀膠的制備與表征

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的Lee法制備納米銀膠[9]。首先，精密稱取36 mg的硝酸銀，溶于200 mL的去離子水中，倒入500 mL三頸燒瓶?jī)?nèi)，加熱并磁力攪拌，當(dāng)溶液微沸時(shí)，保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，將4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸檬酸三鈉水溶液緩慢加入，繼續(xù)回流攪拌加熱60 min，可以觀察到溶液的顏色逐漸由無色透明變?yōu)樯钭厣?，最后變?yōu)榈S色并略顯綠色，停止反應(yīng)后室溫冷卻，即得到粒徑約為50 nm 的納米銀球，最后倒入干凈的棕色瓶中避光保存。由于銀膠屬于介穩(wěn)體系，因此每次取用納米銀膠時(shí)，均需搖晃均勻。取銀膠原溶液1 mL離心(5000 r/min，5 min)，除去上清液，用等量去離子水復(fù)溶，再加去離子水至5 mL，然后在300～500 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外掃描。取銀膠原溶液1 mL離心(5000 r/min，5 min)，除去上清液，加去離子水至1 mL，取2～3 μL滴于硅片上，在紅外燈下照射，待溶劑揮發(fā)完全后進(jìn)行電鏡掃描。

2.4 待測(cè)體系的配制

單鏈DNA初始為粉末狀，加入去離子水配制成濃度為50 μM的母液，置于-20℃的冰箱中儲(chǔ)存。精確稱取KI粉末16.6 mg溶于100 mL去離子水中，得1 mM KI溶液。精確稱取MgSO4粉末60 mg溶于50 mL去離子水中，得10 mM MgSO4溶液?；趨⒖嘉墨I(xiàn)[8]并適當(dāng)改變，用移液槍取2.5 μL濃縮膠，向其中精密加入2.5 μL 1 mM的KI溶液，渦旋，使其充分混合，并在室溫下孵育20 min，以確保KI完全清洗AgNPs表面。然后加入2.5 μL DNA溶液和適量10 mM的MgSO4溶液充分混合，再加去離子水至50 μL，混勻即得。

2.5 SERS檢測(cè)條件的優(yōu)化和檢測(cè)方法的確定

為了獲得更加靈敏的信號(hào)，同時(shí)闡明不同檢測(cè)參數(shù)對(duì)單鏈DNA SERS圖譜的影響，分析單鏈DNA GO18在便攜式拉曼光譜儀的不同檢測(cè)條件下的SERS譜圖。試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為：銀膠濃縮倍數(shù)50倍、100倍和150倍；激發(fā)功率為30%(60 mW)、50%(100 mW)、80%(160 mW)；積分時(shí)間為10 s、20 s、30 s；掃描次數(shù)為1次；顯微系統(tǒng)放大倍數(shù)為20倍；裝樣方式為96孔板、高純度石英毛細(xì)管1.0～0.8(外徑1.0 cm，內(nèi)徑 0.8 cm)、1.0～0.7、1.75～0.9)；凝聚劑MgSO4(10 mM)用量0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL、5.0 μL。分析不同試驗(yàn)參數(shù)對(duì)SERS結(jié)果的影響，以獲得優(yōu)化的檢測(cè)條件。

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用BWSpec4軟件對(duì)采集的原始光譜進(jìn)行平滑(savitzky-golay平滑)、基線校正(airPLS法)等處理。然后用MATLAB 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)做進(jìn)一步的處理，使其能夠用于Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。由于光譜波段400 cm-1之前和1800 cm-1之后幾乎沒有光譜特征，因此選取光譜波段400～1800 cm-1進(jìn)行繪圖分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 納米銀膠的表征

對(duì)制得的銀膠原溶液進(jìn)行紫外掃描和電鏡掃描。掃描電鏡顯示所制得的納米銀膠顆粒呈直徑為50 nm的球體狀態(tài)，且大小分布較為均一。紫外掃描只在410 nm處出現(xiàn)了一個(gè)尖銳的單峰，且其半峰寬較小，反映出納米銀膠顆粒具有良好的分散性與均一性，能夠滿足試驗(yàn)的需要。

3.2 銀膠濃縮倍數(shù)的優(yōu)化

選擇合適的銀膠濃縮倍數(shù)是SERS實(shí)驗(yàn)順利實(shí)施的一個(gè)重要因素。本實(shí)驗(yàn)配制了濃縮50倍、100倍和150倍三種濃縮膠，在其他條件相同的情況下，探究濃縮倍數(shù)對(duì)SERS檢測(cè)結(jié)果的影響。圖1的結(jié)果表明：濃縮100倍與50倍的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度相似，但前者能更快檢測(cè)到穩(wěn)定的信號(hào)，而濃縮150倍的銀膠未能出現(xiàn)正常的ssDNA SERS信號(hào)。原因可能是：50倍濃縮膠中，銀納米顆粒的量相對(duì)較少，不能夠最大程度地增強(qiáng)ssDNA的SERS信號(hào)，而且較少的銀納米顆粒需要更多時(shí)間聚沉到穩(wěn)定狀態(tài)；100倍濃縮膠中銀納米顆粒的數(shù)量相對(duì)充足，能夠最大程度地增強(qiáng)ssDNA的SERS信號(hào)，且較多的銀納米顆粒能夠更快地聚沉至穩(wěn)定狀態(tài)，更快檢測(cè)到穩(wěn)定的SERS信號(hào)；150倍濃縮膠中的銀納米顆粒數(shù)量過多、易聚沉，導(dǎo)致銀膠本身的信號(hào)較強(qiáng)，而ssDNA反而不易與銀膠接觸，導(dǎo)致ssDNA的信號(hào)變?nèi)醵汇y膠本身的信號(hào)掩蓋，出現(xiàn)了異常峰信號(hào)?？傊?，銀膠濃縮100倍時(shí)，能更快地檢到穩(wěn)定且強(qiáng)度大的SERS信號(hào)。

圖1 不同銀膠濃縮倍數(shù)檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Testing results of different silver sol concentrations

3.3 裝樣方式的優(yōu)化

不同裝樣方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果有較大影響，文獻(xiàn)[8]中使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，該方式所需要的樣品量大且待檢體系易于沉淀，所以嘗試選用高純石英毛細(xì)管裝樣。考慮到不同內(nèi)外徑毛細(xì)管管壁不同，單位激光照射面積上的液體體積不同可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響，選用三種不同內(nèi)外徑毛細(xì)管1.0～0.8(表示該高純石英毛細(xì)管外徑1.0 cm，內(nèi)徑0.8 cm，下同)、1.0～0.7、1.75～0.9進(jìn)行檢測(cè)并與96孔板相比較。96孔板的檢測(cè)結(jié)果峰信號(hào)很弱，原因是96孔板中待檢體系出現(xiàn)明顯沉淀，導(dǎo)致激光照射處ssDNA和銀納米顆粒濃度較低。1.75～0.9毛細(xì)管的信號(hào)也明顯低于1.0～0.7和1.0～0.8毛細(xì)管，可能是因?yàn)?.75～0.9毛細(xì)管的管壁較厚，降低了入射激光的效率導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)較弱。1.0～0.8和1.0～0.7毛細(xì)管的檢測(cè)結(jié)果基本相同，但考慮到1.0～0.8毛細(xì)管的內(nèi)徑更大，更有利于移液槍進(jìn)樣，所以后續(xù)都使用1.0～0.8毛細(xì)管裝樣。

3.4 激光功率和積分時(shí)間的優(yōu)化

由于激光功率和積分時(shí)間對(duì)SERS檢測(cè)結(jié)果有比較大的影響，所以對(duì)二者同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化。首先，選擇三個(gè)常用激光功率(30%(60 mW)、50%(100 mW)和80%(160 mW))和三種積分時(shí)間(10 s、20 s、30 s)，再將二者進(jìn)行兩兩組合，即對(duì)9種檢測(cè)條件進(jìn)行比較。激光功率-積分時(shí)間為10 s-30%、10s-50%和20s-30%的峰信號(hào)較弱，而20s-80%、30s-50%、30s-80%的峰信號(hào)超出量程，所以這6種條件加以排除。對(duì)10s-80%、20s-50%、30s-30%這三種檢測(cè)條件進(jìn)行篩選(圖2)，10s-80%的強(qiáng)度略低于20s-50%和30s-30%，而后兩者強(qiáng)度幾乎無差別，但是激光功率為30%(60mW)時(shí)，對(duì)低濃度樣品的檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)限更低，所以最終選擇30s-30%作為優(yōu)化條件。

圖2 激光功率-積分時(shí)間檢測(cè)結(jié)果篩選Fig.2 Screening of laser power-integration time detection results

3.5 凝聚劑MgSO4加入量的優(yōu)化

在檢測(cè)體系中加入MgSO4，可以中和Ag IMNPS表面電荷并增強(qiáng)ssDNA與Ag IMNPS的相互作用，從而能夠檢測(cè)到強(qiáng)烈且可再現(xiàn)的SERS信號(hào)[8]。加入MgSO4量的多少對(duì)檢測(cè)結(jié)果有較大影響，所以考察其加入量。在檢測(cè)體系的配制過程中，分別加入MgSO4(10 mM)0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL、5.0 μL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3?？梢娂尤?.5 μL、1.0 μL MgSO4的信號(hào)較弱，可能是因?yàn)镸gSO4的量不能夠使Ag IMNPS與ssDNA充分凝聚。加入MgSO4體積為2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL、5.0 μL的峰信號(hào)強(qiáng)度無明顯差別，說明2.0 μL MgSO4就足夠使得Ag IMNPS與ssDNA充分凝聚，再增加MgSO4反而可能會(huì)因?yàn)槟蹌┻^多，使得檢測(cè)體系出現(xiàn)沉淀，影響檢測(cè)結(jié)果。因此，加入2.0 μL MgSO4(10 mM)是最優(yōu)的條件。

圖3 不同MgSO4加入量的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Testing results of different MgSO4 addition amount

綜上，便攜式拉曼光譜儀對(duì)單鏈DNA檢測(cè)的最佳條件為：銀膠濃縮100倍，高純石英毛細(xì)管 1.0～0.8(外徑 1.0 cm，內(nèi)徑 0.8 cm)裝樣，激光功率30%(60 mW)，積分時(shí)間30 s，凝聚劑MgSO4(10 mM)2.0 μL。

3.6 方法學(xué)考察與峰位歸屬

3.6.1重復(fù)性考察

按照優(yōu)化后的條件，對(duì)同一濃度待測(cè)體系進(jìn)行6次檢測(cè)，檢測(cè)體系中樣品濃度為2.5 μM，每次取穩(wěn)定后的光譜圖進(jìn)行重復(fù)性的檢驗(yàn)。拉曼位移在788cm-1處出現(xiàn)最強(qiáng)峰，歸屬于PO2-的骨架伸縮振動(dòng)，以該峰峰強(qiáng)計(jì)算RSD值，結(jié)果為4.72%，顯示該方法重復(fù)性較好。

3.6.2穩(wěn)定性考察

按照優(yōu)化后的條件，對(duì)同一待測(cè)體系進(jìn)行了連續(xù)的SERS檢測(cè)，檢測(cè)體系中樣品濃度為2.5 μM，每次測(cè)量間隔為0 s，共采集120張光譜。圖4為第1、2、3、4、5、10、20、40、60、80、100、120張光譜圖，可見前5張圖譜信號(hào)一直上升，然后趨于穩(wěn)定(即檢測(cè)150s后)。主要原因?yàn)椋涸诩尤隡gSO4之后，激光照射下銀納米顆粒的聚集加快，前5張圖譜是在凝聚點(diǎn)到達(dá)穩(wěn)定過程中檢測(cè)的，隨后納米顆粒聚集達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，信號(hào)也隨之穩(wěn)定。

圖4 同一樣品采集120次部分譜圖Fig.4 Part of 120 spectra from the same sample

3.6.3檢測(cè)限考察

按照優(yōu)化后的條件，采用倍比稀釋法配制了ssDNA終濃度為5.0μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.313μM的檢測(cè)體系，如圖5所示，拉曼位移在1094 cm-1處出現(xiàn)最穩(wěn)定特征峰，文獻(xiàn)中已有報(bào)道其為ssDNA中磷酸骨架的特征峰，以此峰計(jì)算檢測(cè)限。當(dāng)樣品最終濃度為0.625μM時(shí)，S/N>3；終濃度為0.313μM時(shí)，S/N<3，因此0.625μM可作為檢測(cè)限。該濃度已低于大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的SERS測(cè)定DNA的濃度，說明優(yōu)化后的方法具有一定優(yōu)勢(shì)。

圖5 不同樣品濃度檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Testing results of different sample concentrations

3.6.4峰位歸屬

文獻(xiàn)中對(duì)ssDNA的SERS峰位進(jìn)行了初步的歸屬但并不詳細(xì)，而且由于方法的改進(jìn)及選用儀器的改變，可能會(huì)與已有報(bào)道的峰位歸屬存在一定的偏差，所以需要對(duì)優(yōu)化條件所得到的SERS圖譜重新進(jìn)行峰位歸屬。

首先設(shè)計(jì)了存在單一堿基類型的單鏈ssDNA序列，即在一條 ssDNA 鏈中所有的堿基類型都為A或T或C或G，即A11、T11、C11、G5(下標(biāo)表示堿基個(gè)數(shù)，需要注意的是，在單鏈ssDNA的合成中，一條鏈中連續(xù)G的個(gè)數(shù)不能超多5個(gè)，因此，G5的堿基個(gè)數(shù)為5個(gè)G，其他序列為11個(gè)同種堿基)。然后分別進(jìn)行SERS檢測(cè)，與樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行歸一化后相對(duì)比。

圖6為A11、T11、C11、G5以及GO18的SERS光譜圖，可以看出，四種不同的ssDNA具有豐富且獨(dú)特的SERS指紋信息。它們?cè)?094cm-1處(歸屬于PO2-的對(duì)稱伸縮振動(dòng))顯示出共同的SERS強(qiáng)峰，在788 cm-1附近也能觀察到明顯的由PO2-骨架伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生的SERS峰，表明在該待測(cè)體系中磷酸骨架非常接近Ag IMNPs表面，從而產(chǎn)生增強(qiáng)的拉曼信號(hào)。A11的SERS光譜在730 cm-1處出現(xiàn)腺嘌呤的主要特征峰，來源于腺嘌呤的環(huán)呼吸振動(dòng)。T11的SERS光譜圖在745 cm-1的峰為胸腺嘧啶的SERS特征峰，來源于胸腺嘧啶的環(huán)呼吸振動(dòng)，同時(shí)1649 cm-1也出現(xiàn)胸腺嘧啶強(qiáng)的特征峰。對(duì)于C11的SERS光譜，其只在683 cm-1左右出現(xiàn)較小的特征峰，而在790 cm-1處出現(xiàn)一強(qiáng)峰，該峰并不完全來源于胞嘧啶的環(huán)呼吸振動(dòng)，而是由于C的環(huán)呼吸振動(dòng)所產(chǎn)生，它與磷酸骨架伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生的788 cm-1處的峰拉曼位移比較接近，兩者重疊后在791 cm-1左右處出現(xiàn)很強(qiáng)的包埋復(fù)合SERS峰。對(duì)于G5的SERS光譜，在683 cm-1、1325 cm-1、1487 cm-1、1576 cm-1處存在其主要的特征峰，分別對(duì)應(yīng)G環(huán)的呼吸振動(dòng)、dG C2′-endo/syn、dG N7 H-bond to H2O、dG δNH (N2HH-bond to H2O)。另外，800 cm-1～1150 cm-1范圍內(nèi)也具有較為豐富的SERS峰，來源于磷酸骨架和脫氧核糖的分子振動(dòng)。

圖6 樣品與單堿基單鏈DNA檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Testing results of the sample and the single-base ssDNA

與文獻(xiàn)相比，可以很明確地發(fā)現(xiàn)方法的改進(jìn)與檢測(cè)儀器的改變會(huì)對(duì)ssDNA的SERS峰位歸屬產(chǎn)生一定的影響(如文獻(xiàn)中PO2-的對(duì)稱伸縮振動(dòng)在1087cm-1處出峰，而本文所測(cè)得的峰為1094cm-1)，主要體現(xiàn)在峰位的小幅度偏移，以及個(gè)別峰的強(qiáng)度差異上。但同時(shí)也可以表明該方法可以真實(shí)地反映ssDNA的基本結(jié)構(gòu)組成的指紋信息，包括堿基、磷酸骨架及脫氧核糖，進(jìn)一步證明了該方法具有較高的可靠性與一定的應(yīng)用前景。

通過對(duì)四種不同單一堿基類型的ssDNA的分析，以及參照已有文獻(xiàn)對(duì)各種ssDNA的SERS峰位歸屬，本文對(duì)改進(jìn)的SERS方法檢測(cè)GO18得到的峰位進(jìn)行了更加完善詳細(xì)的歸屬(表1)。

表1 GO18的SERS峰歸屬Table.1 The SERS peak position assignment of GO18

4 結(jié)論

本文以GO18為例，研究銀膠溶液濃縮倍數(shù)、激發(fā)功率及積分時(shí)間、裝樣方式、凝聚劑MgSO4的用量等不同檢測(cè)條件對(duì)單鏈DNA的SERS檢測(cè)結(jié)果的影響，確定了最佳的檢測(cè)條件。該條件下，方法穩(wěn)定性和重復(fù)性好，峰位歸屬明確，檢測(cè)限達(dá)0.625 μM。本研究為進(jìn)一步擴(kuò)大和推動(dòng)SERS技術(shù)在單鏈DNA檢測(cè)中的應(yīng)用提供了方法基礎(chǔ)。