邢 磊 趙樂樂 袁紅艷 張春華 陸雪林*

1.上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海201103；2.上海欣灝珍禽育種有限公司，上海201408

微衛(wèi)星（SSR）標(biāo)記技術(shù)對加快畜禽性狀選育有很大的優(yōu)勢[1]，關(guān)于雉雞的分子標(biāo)記研究以前尚未有過，而且雉雞的基因組信息也是未知的。因此，本研究利用高通量測序技術(shù)以雉雞基因組為研究對象對雉雞的SSR 分子標(biāo)記進行開發(fā)，構(gòu)建出雉雞SSR 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫，邁開了進行雉雞分子標(biāo)記遺傳研究的第一步。通過設(shè)計特異性引物并經(jīng)過樣本群體的多態(tài)性驗證[2]，得到了可靠的多態(tài)性SSR 標(biāo)記，旨在為雉雞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、基因定位以及分子標(biāo)記輔助育種提供分子水平上的有效工具[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物來源于上海欣灝珍禽育種有限公司飼養(yǎng)的中華環(huán)頸雉（RN）、蒙古雉（MX）和國內(nèi)雉雞（D）的純種后代。3 個品種在同一雞舍、相同管理條件下飼養(yǎng)。

1.2 血液樣本采集及基因組提取

第20 周時，從試驗群體中隨機挑選105 只母雞采集血樣，各樣本翅靜脈取血3 mL，4% EDTA抗凝劑抗凝，-20 ℃保存。利用試劑盒法（天根生化（DP318）血液基因組提取試劑盒）提取血樣基因組，采用TBS380 結(jié)合picogreen 進行濃度和純度檢測，再根據(jù)濃度檢測結(jié)果利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本DNA 的完整性，電壓120 V，時間20 min。所得DNA 于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的引物設(shè)計及篩選

通過454 平臺高通量測序，利用MISA 程序在序列中搜索SSR 位點，利用primer3_2.2.3 對搜索得到的SSR 位點設(shè)計特異性引物。擴增目標(biāo)片段為重復(fù)序列前1 個堿基到后5 個堿基的片段，擴增產(chǎn)物長度在100～400 bp 之間。設(shè)計引物時，遵循一般的引物設(shè)計原則，并對PCR 產(chǎn)物長度及范圍、引物退火溫度范圍、GC 含量、長度等進行嚴(yán)格限定，從而進行相關(guān)參數(shù)的調(diào)整。然后選擇分布均勻的SSR 位點通過90 個樣本逐級PCR 反應(yīng)篩選多態(tài)性位點。PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中ddH2O 14 μL，10×Buffer 2 μL，DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.50 μL，dNTP 0.5 μL，Taq 酶0.5 μL。PCR 擴增反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.4 微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型判定及數(shù)據(jù)分析

利用確定的8 對多態(tài)性SSR 設(shè)計熒光引物上ABI 3730XL 測序儀進行毛細管電泳，進而進行基因型判定并進行數(shù)據(jù)分析。用POPGENE3.2 統(tǒng)計觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）等。多態(tài)信息含量（PIC）用軟件LittlePrograme 計算。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過逐級多態(tài)性驗證，最終確定8 條多態(tài)性SSR 序列，具體信息見表1。8 對微衛(wèi)星在所有雉雞個體中均能成功擴增。

觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度見表2，多態(tài)信息含量見表3。由表2可知，RN 群體中，觀測等位基因數(shù)平均為5.38，每個位點從1（zll-12）到9（zll-30 和zll-68）不等，有效等位基因數(shù)平均為3.64。MX 群體中，觀測等位基因數(shù)平均為5.75，每個位點從2（zll-12）到10（zll-68）不等，有效等位基因數(shù)平均為3.65。D 群體中，觀測等位基因數(shù)平均為5.13，每個位點從2（zll-12）到11（zll-30）不等，有效等位基因數(shù)平均為3.45。對8個微衛(wèi)星標(biāo)記群體雜合度計算結(jié)果（表2）顯示，RN群體平均觀察雜合度、期望雜合度、Nei 期望雜合度分別為0.60、0.60、0.59；MX 群體平均觀察雜合度、期望雜合度、Nei 期望雜合度分別為0.60、0.62、0.61；D 群體平均觀察雜合度、期望雜合度、Nei 期望雜合度分別為0.56、0.61、0.59。

根據(jù)表3 統(tǒng)計結(jié)果可知，8 個位點在RN、MX、D 三個群體中，除zll-12、zll-61 的PIC 小于0.5 外，其余6 個位點的PIC 值均高于0.5，說明所選取的位點大多為高多態(tài)位點（圖1）。zll-30 與zll-68 的多態(tài)信息含量在3 個群體中均較高，zll-30 在D 群體中多態(tài)信息含量達0.89，zll-68 的多態(tài)信息含量在3 個群體中均超過了0.83。

3 討論

因為國內(nèi)雉雞品種（D）和由美國引進的原種雉雞2 個品種中華環(huán)頸雉（RN）和蒙古雉（MX）屬于同一物種，因此從3 個品種中隨機選擇國內(nèi)雉雞品種（D）的1 個樣本進行高通量測序，從而得到雉雞所擁有的SSR 位點。雉雞并沒有基因組序列和注釋信息可進行參考，只能按照無參考基因組序列的物種進行SSR 分子標(biāo)記的開發(fā)，然后通過PCR 和一代測序試驗驗證方法篩選出可用的SSR 分子標(biāo)記。針對未知基因組信息的雉雞群體，采用454 測序平臺結(jié)合SSR 富集文庫測序的高通量測序方法進行雉雞SSR 分子標(biāo)記的開發(fā)，很好地解決了近緣物種引物交叉擴增所帶來的無PCR 產(chǎn)物的高風(fēng)險，而且454 平臺能夠提供足夠的側(cè)翼序列用于特異性PCR引物設(shè)計[4]。SSR 富集文庫的構(gòu)建能夠減少測序數(shù)據(jù)量，降低測序成本，提高開發(fā)效率，分析手段目標(biāo)更明確、更經(jīng)濟、快速、高效，也為研究其他未知基因組信息的物種的分子標(biāo)記提供了思路和方法。

表1 多態(tài)性SSR 引物信息

表2 雉雞群體的等位基因數(shù)和雜合度

表3 雉雞群體的多態(tài)信息含量

圖1 三個群體中8 個微衛(wèi)星位點PIC 含量分布

有效等位基因數(shù)越接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻[5]。本研究中8 個微衛(wèi)星標(biāo)記在雉雞群體中有效等位基因數(shù)最小為1，最大為8.45，反映出8 個微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因在群體中分布不均勻?；螂s合度被認為是度量群體遺傳變異的最適參數(shù)。雜合度越低，表明該群體遺傳一致性越高，遺傳多樣性也越低[6]。對于分子遺傳標(biāo)記，Helentjaris 等[7]提出用多態(tài)信息含量值（PIC）衡量基因變異程度高低、反映遺傳信息的多少。多態(tài)信息含量是等位基因頻率和等位基因數(shù)的變化函數(shù)。當(dāng)位點PIC＞0.5 時，該位點為高度多態(tài)位點；當(dāng)位點0.25＜PIC＜0.5 時為中度多態(tài)位點；當(dāng)PIC＜0.25 時為低度多態(tài)位點。zll-30 與zll-68的多態(tài)信息含量在3 個群體中均較高。多態(tài)信息含量（PIC）和遺傳雜合度（He）都是表示群體內(nèi)遺傳變異的指標(biāo)。從保種的角度來考慮，我們要保持品種的遺傳多樣性，只有PIC 和He 數(shù)值大，才能說明群體遺傳多樣性比較豐富。所以，由表2 和圖1 可知，本研究所選雉雞群體的遺傳多樣性非常豐富，這與雉雞的實際繁養(yǎng)情況相符合。因為國內(nèi)雉雞養(yǎng)殖長期處于散養(yǎng)狀態(tài)，并且沒有受到高強度的選擇。

4 結(jié)論

在雉雞生產(chǎn)中，雉雞羽色、頸環(huán)大小、產(chǎn)蛋性能等都是影響雉雞企業(yè)經(jīng)濟效益的重要因素。采用傳統(tǒng)育種與分子標(biāo)記結(jié)合的選擇育種，可有效提高雉雞生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。本研究利用8 對微衛(wèi)星標(biāo)記對雉雞群體進行多態(tài)性檢測，旨在為下一步指導(dǎo)雉雞分子育種提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。