楊 希 郎巧利 黃 楠 余 琳 吳 夢 葛良鵬

(重慶市畜牧科學院，重慶市醫(yī)用動物資源的開發(fā)與利用工程技術研究中心,重慶 402460)

T淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成成分，具有直接殺傷靶細胞的功能，能對特異性抗原產(chǎn)生免疫應答反應并分泌細胞因子[1-4]。CD3是T淋巴細胞表面重要的標志蛋白，能與T細胞表面受體(T-cell receptor,TCR)形成CD3/TCR復合物，從而介導T淋巴細胞識別抗原和信號[5]。在CD3/TCR復合物中，TCR的基因在表達過程中發(fā)生重排，其序列是多變的，而CD3蛋白是保守的，不是抗原特異性的[6]。CD3蛋白是參與細胞的信號傳導、分化、增殖及發(fā)揮效應功能的主要物質(zhì)基礎，CD3抗體能夠阻斷或激發(fā)T細胞活化。世界上第一個CD3抗體OKT3(ortho Kung T3,murine IgG2a)能與T淋巴細胞表面CD3蛋白結合從而阻斷T細胞活化，起到免疫抑制作用，在早期被用于治療腎移植中的同種異體排斥反應[7,8]。然而鼠CD3抗體對人體是異源蛋白，應用于人體時可引起人抗鼠抗體反應(HAMA)，可加快人體對鼠源抗體的清除從而阻斷抗體治療效果，也可誘導變態(tài)反應發(fā)生危及生命，其毒副作用極大地限制了其臨床使用和推廣[9,10]。Kimball等[11]收集30例心臟、30例腎臟和30例肝臟移植受者270份血清，這些受者之前沒有接觸過小鼠OKT3，但接受小鼠OKT3誘導免疫抑制治療。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有血清中均具有較高滴度的人抗OKT3的IgG抗體。Chatenoud等[12]發(fā)現(xiàn)OKT3小鼠單克隆抗體在人體內(nèi)發(fā)生強烈的人抗小鼠抗體反應，嚴重影響了OKT3治療效果。隨后，許多研究者將CD3鼠抗人源化處理，獲得了眾多的人源化CD3抗體，包括teplizumab (huOKT3γ1)[13-15],otelixizumab[16,17](aglycosylated rat YTH12.5)和visilizumab[18,19](HuM 291)。人源化改造極大程度地減少了HAMA反應，增加了抗體的耐受性。然而這些人為的修改仍然不能完全消除異種蛋白潛在的風險[20]，全人源抗體是抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點方向。

CD3蛋白空間結構復雜，由CD3γ、CD3δ、CD3ε(CD3E)、CD3ζ、CD3η五種肽鏈組成。其中CD3E包含1個免疫球蛋白樣亞基和1個免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)，是CD3蛋白重要組成部分，缺失CD3E基因會導致機體嚴重的免疫缺陷，是CD3抗體常用的蛋白靶點[21-24]。本研究擬根據(jù)人CD3E基因序列，構建表達CD3E胞外區(qū)的重組表達質(zhì)粒，通過293F懸浮細胞表達系統(tǒng)表達并純化獲得CD3E蛋白，免疫人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠CAMouse-HG76，通過細胞融合和抗體篩選制備針對人CD3的全人源單克隆抗體，為后續(xù)建立CD3蛋白的ELISA檢測方法、開發(fā)全人源CD3治療性抗體藥物及相關研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料 質(zhì)粒pcDNA3.4購自Invitrogen公司；293F細胞購自北京諾進生物技術有限公司；細胞用耗材(除特殊說明)均購自CORNING公司；EasyPure HiPure Plasmid MaxiPrep Kit購自北京全式金生物技術有限公司；E.coliDH5α Competent Cells購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；TransCult LB Agar Plate (Ampicillin) 培養(yǎng)皿購自北京全式金生物技術有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)液購自美國Gibico公司；HITRAP PROTEIN G HP購自GE公司；人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠CAMouse-HG76購自重慶金邁博生物科技有限公司；Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein購自ACROBiosystems公司；Mouse Anti-Human IgG Fab Monoclonal Secondary Antibody (A01855)購自南京金斯瑞生物科技有限公司；Ficoll Paque PLUS購自GE公司；Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) preadsorbed (ab7064)購自Abcam公司；PBST購自Solarbio公司；弗氏佐劑(弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)、谷氨酰胺、PEI(聚乙烯亞胺)購自Sigma；ClonaCellTM-HY Hybridoma Kit購自STEMCELL Technologies公司；Human CD3 (huma-nized OKT3) Antibody-Human IgG4 (GMP-grade)、293F細胞基礎培養(yǎng)液購自北京義翹神州生物技術有限公司；SDS-PAGE(NuPAGETM10% Bis-Tris Protein Gels)購自Invitrogen公司； His-probe antibody (H-3):sc-8036 Alexa Fluor?680購自Santa Cruz Biotechno-logy公司。

1.2方法

1.2.1CD3E蛋白真核表達純化

1.2.1.1表達載體的構建 本實驗參照CD3E基因(Gene ID:916)的DNA序列信息，體外合成其胞外區(qū)序列，同時在其末端加入mouse IgG2 Fc和6×His(Fc標簽用于純化，His標簽用于Western blot鑒定)，再通過EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點連接入真核表達載體pcDNA3.4中獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.4-CD3E-mFc。

1.2.1.2質(zhì)粒的大量提取與鑒定 按照E.coliDH5α Competent Cells使用說明書，將10 ng重組質(zhì)粒DNA加入到冰上融化的感受態(tài)細胞中后冰上放置30 min，42℃熱激45 s，再在冰上放置1 min，加入已經(jīng)預熱到37℃的SOC培養(yǎng)液到1 ml，37℃震蕩培養(yǎng)1 h。將培養(yǎng)好的菌液取100 μl涂布TransCult LB Agar Plate (Ampicillin) 培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12～18 h。

1.2.1.3293F細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的293F細胞按照0.8×106cells/ml密度進行傳代。第二天，待細胞長到1.5×106cells/ml，并且細胞活率大于95%后，將細胞稀釋到1×106cells/ml后進行轉(zhuǎn)染。

取2個無菌的2 ml EP管，一個加入200 μl Opti-MEM 293F基礎培養(yǎng)液和20 μg 重組質(zhì)粒DNA(濃度為1.5 mg/ml)，另一個加入200 μl Opti-MEM 293F基礎培養(yǎng)液和60 μl PEI(1 μg/μl)，各自混勻后室溫孵育 5 min。再將混勻的PEI溶液快速加入混勻的重組質(zhì)粒DNA中，用移液槍輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min，再逐滴加入準備好的293F細胞中，邊加邊輕輕振蕩細胞。將轉(zhuǎn)染好的細胞置于震動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天用臺盼藍染色法計算細胞活率，當活細胞量下降至60%左右時，400 g離心20 min收取細胞上清液。

1.2.1.4蛋白純化 利用HITRAP PROTEIN G HP進行上清中蛋白的純化。先用5倍柱體積的超純水沖洗柱子，再用5倍柱體積的結合緩沖液(20 mmol/L PB buffer，0.2 mol/L NaCl，pH=7.2)平衡柱子。將收集的細胞上清用0.45 μm濾膜過濾后與等體積的結合緩沖液混合，再上樣，流速為1 ml/min，收集流穿液。用10倍柱體積的結合緩沖液洗柱子，直到紫外和電導均為基線。用洗脫緩沖液(100 mmol/L 甘氨酸，pH=2.7)洗脫至中和緩沖液(1 mol/L Tris-HCl，pH=9.0)中，流速1 ml/min。洗脫后立即用10倍柱體積的結合緩沖液重新平衡柱子。再將純化后的蛋白用PBS透析過夜后用超濾管濃縮并調(diào)整濃度至2 mg/ml。

1.2.1.5SDS-PAGE和Western blot 將獲得的蛋白取10 μl進行SDS-PAGE，并通過電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用1.5%的脫脂奶粉封閉，室溫孵育1.5 h；棄封閉液，加入稀釋好的抗體His-probe antibody (H-3):sc-8036 Alexa Fluor?680(1∶1 000稀釋)，室溫孵育2 h；用TBST緩沖液洗滌3～5次，3～5 min/次；用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)成像。

1.2.2單克隆抗體制備

1.2.2.1免疫小鼠 以弗氏佐劑作為佐劑，按照說明書，每間隔2周免疫1次，每次免疫后第7天采血檢測血清效價。細胞融合前3 d取200 μg/只的蛋白直接進行脾臟加強免疫。

1.2.2.2血清效價檢測 Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein以0.5 μg/ml包被于ELISA板中，4℃孵育過夜；用PBST洗3次，加入1%BSA封閉2 h； PBST洗3次，加入倍比稀釋的血清(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800)(同時設置未免疫小鼠血清作為陰性對照)，室溫孵育1 h；PBST洗3次，加入1∶5 000稀釋的mouse Anti-Human IgG Fab Monoclonal Secondary Antibody (A01855)，室溫孵育1 h；PBST洗3次后，加入TMB進行顯色20 min；加入2 mol/L硫酸溶液終止，用酶標儀讀取OD450 nm值。以大于2.1倍陰性值作為陽性。

1.2.2.3細胞融合 細胞融合前3 d取200 μg/只的蛋白直接進行脾臟加強免疫。頸椎脫臼法快速處死免疫小鼠，分離其脾臟淋巴細胞。將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶5 混合后通過微納秒復合脈沖電融合法進行細胞融合，設置納秒融合參數(shù)為10 KV/cm、200 ns、8次，微秒融合參數(shù)為2.5 KV/cm、20 μs、1次。將融合細胞按照ClonaCellTM-HY Hybridoma Kit在半固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并且單克隆化。當培養(yǎng)10～14 d后，肉眼可見單個克隆，用10 μl槍頭挑單個克隆于新的鋪滿滋養(yǎng)層細胞的96孔板中進行培養(yǎng)，2～3 d培養(yǎng)液顏色變黃以后，吸出上清做ELISA檢測和流式分析。

1.2.2.4ELISA篩選 Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein以0.5 μg/ml包被于ELISA板中，4℃孵育過夜；用PBST洗3次，加入1%BSA封閉2 h；PBST洗3次，加入雜交瘤上清，室溫孵育1 h；PBST洗3次，加入1∶5 000稀釋的Mouse Anti-Human IgG Fab Monoclonal Secondary Antibody (A01855)，室溫孵育1 h；PBST洗3次后，加入TMB進行顯色20 min；加入2 mol/L硫酸溶液終止，用酶標儀讀取OD450 nm值。

1.2.2.5雜交瘤細胞株的流式檢測 按照人淋巴細胞分離液Ficoll Paque PLUS使用說明書分離人PBMC，調(diào)整細胞濃度為2×105cells/200 μl用于后續(xù)實驗。取200 μl的PBMC加入100 μl雜交瘤上清或同型非相關雜交瘤抗體上清(本實驗室保留)，4℃孵育30 min；用含2%FBS的PBS緩沖液清洗細胞2次；加入Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) preadsorbed (ab7064)(1∶1 000稀釋)；用含2%FBS的PBS緩沖液清洗細胞3次；每個樣品加入400 μl 2%FCS PBS緩沖液，混勻，用于流式細胞儀上樣檢測。

2 結果

2.1人CD3E表達載體的鑒定 如圖1所示，將獲得的重組表達質(zhì)粒pcDNA3.4-CD3E-mFc用Bglll限制性內(nèi)切酶酶切后，獲得4 182 bp和2 924 bp的兩條帶，與預期相符。

2.2人CD3E-mFc蛋白真核表達及純化 轉(zhuǎn)染當天細胞活率為99%(轉(zhuǎn)染當天計為第0天)，轉(zhuǎn)染后第9天細胞活率下降至59%，停止培養(yǎng)，離心收集細胞上清。用Protein G柱純化后，進行SDS-PAGE和Western blot分析。如圖2、3所示，CD3E-mFc蛋白理論大小為39.4 kD，但是CD3E蛋白存在多個糖基化位點，其實際表達的蛋白要略大。SDS-PAGE結果顯示，CD3E-mFc蛋白約為85%，可以用于后續(xù)小鼠免疫。

2.3CAMouse-HG免疫效果檢測 以純化后的CD3E-mFc蛋白作為抗原免疫CAMouse-HG76小鼠，第6次免疫后第7天采血，使用ELISA法檢測血清中抗體的效價。如圖4所示，以OD450 nm值大于2.1倍陰性值(未免疫鼠)為陽性判定標準，則4394#、4401#、4403#效價為1∶102 400，4404#效價為1∶51 200，4396#、4397#、4400#效價為1∶25 600。

2.5ELISA法篩選單克隆抗體 選取4394#小鼠進行細胞融合實驗(其余小鼠用于其他實驗)。雜交瘤細胞上清用ELISA法檢測篩選，以OD450 nm值大于2.1倍陰性值(同型非相關雜交瘤抗體上清)為陽性判定標準。ELSIA結果表明，陰性對照平均OD450 nm=0.099，OD450 nm≥2的有22個克隆，2>OD450 nm≥1的有23個克隆，1>OD450 nm≥0.5的有39個克隆，0.5>OD450 nm≥0.21的有39個克隆。因此ELISA篩選共獲得140個陽性克隆。

圖1 pcDNA3.4-CD3E-mFc酶切鑒定圖Fig.1 Restriction enzyme analysis of pcDNA3.4-CD3E-mFcNote: M.DL10 000 marker;1.Bglll mono-enzyme digestion of pcDNA3.4-CD3E.

圖2 SDS-PAGE結果Fig.2 Results of SDS-PAGENote: M.Blue plus IV protein marker (10-180 kD)；1.Supernatant solution of transfected 293F cells；2.Washing product；3.Elution product.

2.6ELISA法篩選單克隆抗體 將ELISA篩選獲得的陽性克隆的細胞上清做流式細胞分析，結果表明(圖5)篩選獲得了3個能與細胞表面CD3結合的抗體：20-2G、41-2B、57-12E。

圖3 Western blot結果Fig.3 Results of Western blotNote: M.Blue plus IV protein marker (10-180 kD)；1.Supernatant solution of transfected 293F cells；2.Flowing fluid;3.Washing product；4.Elution product.

圖4 ELISA檢測CAMouse-HG76血清抗體效價Fig.4 Antibody titers of CAMouse-HG76 sera detected by ELISA

圖5 雜交瘤上清流式細胞分析Fig.5 FACS analysis of hybridoma supernatant

3 討論

CD3抗體在生物醫(yī)藥領域具有極其廣闊的應用前景。臨床前研究表明，口服抗CD3單克隆抗體是一種有效的全身免疫調(diào)節(jié)方法，可以在不消耗T細胞的情況下減輕免疫介導的疾病。Ilan等[20]綜合評價了口服CD3單克隆抗體在治療非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的重要作用。人體試驗表明，在健康志愿者、慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者、NASH和2型糖尿病患者中口服抗CD3藥物是安全的、耐受性良好的，并且具有生物活性?？诜笴D3誘導調(diào)節(jié)性T細胞，抑制與NASH相關的慢性炎癥狀態(tài)，對臨床相關參數(shù)發(fā)揮有益作用。同時CD3也可用于介導T細胞對靶細胞的識別殺傷作用。B7同源蛋白4 (B7-h4)是一種免疫檢查點分子，負調(diào)控免疫反應，已知在許多人類癌癥中過表達。Iizuka等[21]設計獲得了一種B7-H4/CD3雙特異性抗體，該抗體在體外和體內(nèi)實驗中均顯現(xiàn)出強抗腫瘤活性，可能是B7-H4蛋白陽性乳腺癌的良好治療工具。Ma等[22]構建了B7-H3/CD3雙特異性抗體，發(fā)現(xiàn)該抗體可以特異性的抑制B7-H3蛋白陽性腫瘤生長。與此同時，CD3抗體也常和免疫抑制性抗體組合作戰(zhàn)，增強療效[24]。CD47是腫瘤細胞逃逸巨噬細胞識別，從而逃避免疫系統(tǒng)攻擊的表面膜蛋白。Xu等[23]利用CD47抗體和CD19/CD3雙功能抗體聯(lián)合使用，使淋巴瘤得到持續(xù)控制，從而增強了治療效果。PD-1(程序性死亡受體-1)是表達在T細胞表面的一種重要的免疫抑制跨膜蛋白。腫瘤細胞能夠表達其配體PD-L1或PD-L2，當配體與PD-1結合后，T細胞就不能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤，不能發(fā)出攻擊腫瘤信號[25,26]。Horn等[27]設計了一種PD-1/CD3雙功能抗體，可以激活T細胞，同時也對PD-L1陽性腫瘤細胞具有顯著細胞毒性。在體內(nèi)實驗中，PD-1/CD3也顯現(xiàn)出顯著的腫瘤殺傷活性。

CD3是一個有多條肽鏈組成的多聚蛋白，本研究選擇了其中具有重要生物活性的CD3E作為靶點。CD3E中含有多個糖基化位點，本研究選擇通過293F表達系統(tǒng)表達該蛋白的胞外區(qū)域。293F細胞是從HEK293(人胚腎細胞)中分離出的一種能夠在無血清培養(yǎng)液中高密度培養(yǎng)的懸浮細胞，轉(zhuǎn)染效率非常高，即使用價格便宜的PEI配制的試劑進行轉(zhuǎn)染也可以獲得高產(chǎn)量的蛋白，并且表達蛋白結構接近人體內(nèi)構象。為了便于后期純化，本研究在CD3E末端連接了小鼠Fc區(qū)域進行融合表達CD3E-Fc蛋白，其理論值大小為39.4 kD，而SDS-PAGE和Western blot結果發(fā)現(xiàn)，實際值略偏大(約43 kD左右)，這可能是CD3E蛋白存在多個糖基化位點所導致的。

CD3E是一種人蛋白，許多研究是通過與人Fc融合促進其表達和純化，本研究選擇小鼠的Fc進行融合表達，一方面可以促進CD3E的表達和純化，同時在后期免疫小鼠時，小鼠Fc蛋白在小鼠體內(nèi)免疫原性極低，使小鼠產(chǎn)生大量的只針對CD3E的抗體。

為了獲得全人源CD3抗體，本研究選擇中國自主知識產(chǎn)權的人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠CAMmouse-HG76品系。用表達的CD3E-mFc蛋白免疫該小鼠血清效價高達1∶102 400，可用于后續(xù)的細胞融合實驗。

由于人CD3蛋白結構的特殊性和復雜性，獲得人CD3抗體非常困難。CD3是一個多聚膜蛋白，擁有多條肽鏈，目前在體外無法獲得其天然折疊狀態(tài)的CD3蛋白。在雜交瘤的ELISA篩選中，本研究選擇了目前最為接近CD3蛋白的Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein，其與CD3抗體SP34-2和OKT3均具有良好的濃度依賴的結合活性[27]。本研究以OD450 nm值大于2.1倍陰性值(同型非相關雜交瘤抗體上清)為陽性判定標準，共篩選獲得140個陽性克隆。為了進一步檢測抗體與天然CD3的結合活性，本實驗分離了人外周血單核細胞進行流式細胞分析，結果顯示只有20-2G、41-2B、57-12E這三個抗體具有結合活性。這說明篩選所用的蛋白Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein與天然CD3蛋白的結構仍具有顯著的差異。

本研究在體外利用真核表達系統(tǒng)表達并純化獲得了人CD3E蛋白胞外區(qū)，免疫人源化抗體轉(zhuǎn)基因小鼠，細胞融合后通過ELISA檢測和流式細胞分析成功篩選獲得了3株CD3單克隆抗體，為后續(xù)建立CD3蛋白的ELISA檢測方法、開發(fā)全人源CD3治療性抗體藥物及相關研究提供基礎。