宮曉麗 魏瑗 趙揚(yáng)玉

(北京大學(xué)第三醫(yī)院，北京 100191)

成骨發(fā)育不全(osteogenesis imperfecta，OI)又稱脆骨病(brittle bone disease)，是一種罕見的先天性結(jié)締組織病，具有家族性和遺傳性，也有少數(shù)為基因突變產(chǎn)生的散發(fā)病例，主要表現(xiàn)為骨脆性增加、骨密度降低，部分患者也會伴有其他器官的異常，如藍(lán)鞏膜、耳聾、關(guān)節(jié)松弛、牙質(zhì)發(fā)育不全及肌肉力量薄弱等，病情的嚴(yán)重程度從輕微幾乎無癥狀到導(dǎo)致圍產(chǎn)兒死亡，其發(fā)病率為1/10000～1/20000[1]。2018年5月我國《第一批罕見病目錄》將其收錄其中。

1 成骨發(fā)育不全的分型與遺傳

OI分型最為經(jīng)典的方式是Sillence等[2]在1979年根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征將OI分為Ⅰ～Ⅳ型，這4種類型最主要的形成原因是編碼Ⅰ型膠原蛋白的基因COL1A1或COL1A2發(fā)生突變；隨后Glorieux等[3-5]又依據(jù)Ⅳ型特殊的臨床表現(xiàn)，將其擴(kuò)展為Ⅴ～Ⅷ型。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的與OI相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，OI的分型也根據(jù)新基因發(fā)現(xiàn)的先后順序依次列出，但此種分型方式也引起了廣泛的爭議[6]，2015年發(fā)布的遺傳性骨骼疾病的疾病學(xué)和分類(The Nosology and Classification of Genetic Skeletal Disorders)中依舊采用了依據(jù)臨床表型(而非分子類型)分類的辦法將OI分為Ⅰ～Ⅴ型[7,8](表1)。

本病的遺傳方式以常染色體顯性遺傳為主，致病基因有50%的幾率遺傳給下一代，但在同一家系內(nèi)，其臨床表型也不全然相同。張浩等[9]對中國123個OI家系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有17.1%的家系存在表型不一的現(xiàn)象，且先證者的表型均較其他家庭成員嚴(yán)重，其中有2例先證者的甲基化程度高于他們的母親，1例先證者的父親存在體細(xì)胞基因鑲嵌(未檢測生殖細(xì)胞)，父親表型只有藍(lán)鞏膜，身高矮，并無骨折，這與Pyott等[10]的發(fā)現(xiàn)相同，有基因鑲嵌的父親或母親其表型較輕甚至正常，但此類夫妻若生育的第一胎為致死型OI，生育第二胎時，復(fù)發(fā)率達(dá)27%，這可能與生殖細(xì)胞鑲嵌突變有關(guān)。同時也有研究[11]支持這種個體表型的差異可能是由DNA甲基化導(dǎo)致。這就提示我們對于父母OI表型輕微或正常的家系，也應(yīng)警惕胎兒嚴(yán)重OI的發(fā)生，需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

表1 OI分型及臨床表現(xiàn)一覽表

注：AD表示常染色體顯性遺傳；AR表示常染色體隱性遺傳

2 成骨發(fā)育不全的產(chǎn)前診斷

嚴(yán)重的OI導(dǎo)致不良的圍產(chǎn)結(jié)局，給家庭和社會造成沉重的負(fù)擔(dān)，給患者帶來極大的心理壓力。一項(xiàng)針對OI患者監(jiān)護(hù)人的研究表明[12]，當(dāng)患者病情嚴(yán)重，身體功能下降時，監(jiān)護(hù)人的壓力更大，生活質(zhì)量評分(quality oflife，QOL)更低。近年來，影像學(xué)和分子遺傳學(xué)新技術(shù)的發(fā)展，在一定程度上減少了此類患兒的出生。

臨床上主要通過產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)可能與OI有關(guān)的骨骼異常，OI的分型在一定程度上影響到超聲檢查的結(jié)果，嚴(yán)重的Ⅱ型在妊娠14～16周就會出現(xiàn)骨骼的異常改變，典型的超聲表現(xiàn)為四肢短小且長骨短粗、彎曲、多處骨折并骨折后成角；胸廓變形；顱骨柔軟變薄[13]。其他類型的OI超聲表現(xiàn)出現(xiàn)較晚且不典型，有些僅表現(xiàn)為股骨較相同孕齡胎兒正常預(yù)測值短，部分輕型的超聲結(jié)果可為正常。對懷疑有胎兒骨骼發(fā)育異常的應(yīng)定期復(fù)查，避免漏診。2003年李勝利等[14]首次提出了“連續(xù)順序追蹤超聲法”，該法的產(chǎn)前胎兒肢體畸形檢出率高達(dá)87.6%。同時還應(yīng)注意與軟骨發(fā)育不全的鑒別。

2010年歐洲分子遺傳實(shí)驗(yàn)質(zhì)控網(wǎng)(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)。針對OI制定了分子遺傳學(xué)診斷實(shí)踐指南[15]，建議首先對最常見的COL1A1、COL1A2致病基因進(jìn)行檢測，當(dāng)這兩項(xiàng)基因未發(fā)現(xiàn)異常時，再檢測其他基因，具體流程見圖1。

圖1 EMQN推薦的OI分子遺傳學(xué)診斷流程

此流程同樣適用于產(chǎn)前診斷，避免了患病胎兒的出生，應(yīng)用于胚胎植入前基因診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)，可從根本上杜絕患病胎兒的形成。Anick De Vos等[16]報道了兩對夫妻中的一方分別為OI Ⅰ型和OI Ⅳ型患者，經(jīng)PGD均順利妊娠并分娩健康的雙胞胎；2018年陳大蔚等[17]報道了國內(nèi)首例COL1A2基因突變PGD，患者孕期行臍血穿刺顯示為正常胎兒，孕37周分娩一健康女嬰，隨訪至1歲各項(xiàng)指標(biāo)無異常。對于檢測發(fā)現(xiàn)的非經(jīng)典基因變異，尚不能確定其與OI表型的關(guān)系，需做好遺傳咨詢。

自1997年盧煜明等[18]發(fā)現(xiàn)母體外周血中存在胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)后，隨著下一代測序技術(shù)(next-generation sequencing technology，NGS)的誕生，基于NGS的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)(non-invasive prenatal testing，NIPT)被應(yīng)用于臨床并快速發(fā)展，相比于有創(chuàng)的產(chǎn)前診斷，NIPT具有無創(chuàng)、低風(fēng)險、可早期獲得結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)主要用于篩查21-三體、18-三體和13-三體，部分實(shí)驗(yàn)室也用來篩查性染色體異常，一項(xiàng)Meta分析顯示NIPT對篩查21-三體的敏感度和特異度分別為99.3%和99.9%[19]。隨著研究的深入，利用ccfDNA對單基因病進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷(non-invasive prenatal diagnosis，NIPD)也初見成效，如軟骨發(fā)育不全(achondroplasia，ACH)和致死性骨發(fā)育不全(thanatophoric dysplasia，TD)[20]，先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia，CAH)[21]、囊性纖維化(cysticfibrosis，CF)[22]、血友病等[23]。Yin等[24]首次報道利用NIPD對OI的COL1A1新發(fā)突變進(jìn)行診斷，1例妊娠26周的女性行超聲檢查考慮胎兒可能患有OI，在妊娠30周時行臍血穿刺并留取母體外周血5ml，經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證，患兒的COL1A1突變不來自父母，為新發(fā)突變，結(jié)果與研究者利用假四倍體基因型(pseudo tetraploid genotyping，PTG)算法進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的結(jié)果一致。這項(xiàng)研究表明PTG算法可幫助NIPD技術(shù)診斷新發(fā)突變，而不需要通過父母驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上隨著技術(shù)的發(fā)展，將會有更多的單基因病可在產(chǎn)前被診斷出來。

3 成骨發(fā)育不全產(chǎn)前治療

目前對于OI的治療主要是出生后通過藥物提高骨密度、降低骨吸收、減少骨折來改善癥狀，同時輔以手術(shù)矯正畸形，可在一定程度上改善患者的生活質(zhì)量，最常用的藥物為二磷酸鹽，靜脈使用二磷酸鹽可誘導(dǎo)OI患兒椎體壓縮性骨折后重建，但對預(yù)防脊柱側(cè)凸并沒有明顯的效果，有報道顯示首次注射二磷酸鹽可能會出現(xiàn)流感樣綜合征，其特征為發(fā)燒、肌肉疼痛和嘔吐[25]，另外，口服二磷酸鹽的作用尚不明確[26,27]。其他的藥物包括狄諾塞麥、合成代謝制劑等[6]，其有效性和安全性需要更多的臨床數(shù)據(jù)支持。

OI的最佳治療窗口是在宮內(nèi)，近幾年對OI的宮內(nèi)治療取得了一定的效果。間充質(zhì)干細(xì)胞[21](mesenchymal stem Cells，MSCs)，是僅次于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSC)、臨床研究最為廣泛的一種多能干細(xì)胞，來源于成人骨髓、脂肪，或胎盤、臍血及孕早期胎兒的外周血、肝臟等，具有分化為骨、軟骨、肌肉和脂肪等其他相關(guān)組織的能力[29]。組織受到損害后，釋放出基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)等趨化因子，SDF-1的主要受體為CXCR4，CXCR4廣泛表達(dá)在與血管和器官生成有關(guān)的細(xì)胞(如干細(xì)胞)和組織，趨化因子在損傷周圍形成化學(xué)梯度使干細(xì)胞定向歸巢并分化成相應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)[30]。相對出生后使用干細(xì)胞治療，在宮內(nèi)時胎兒免疫系統(tǒng)對MSCs無排斥反應(yīng)，且產(chǎn)生免疫耐受，也無需清除骨髓細(xì)胞[32-34]。已有較多動物試驗(yàn)證實(shí)了MSCs對OI的宮內(nèi)治療取得了較為理想的效果[35-38]，在此基礎(chǔ)上，有研究者將其應(yīng)用于人體[39,40]。

2005年，1例26歲的瑞典女性在妊娠15周時做超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒的股骨長低于5th，羊水穿刺結(jié)果顯示染色體核型正常；妊娠24～27周的超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒發(fā)生了股骨成角骨折，考慮診斷為OI；妊娠30周時醫(yī)生建議嘗試MSCs的宮內(nèi)治療，在充分了解試驗(yàn)風(fēng)險后，夫婦選擇使用MSCs治療。Le等將來源于妊娠早期人工流產(chǎn)的男性胎兒肝臟的MSCs(志愿者捐獻(xiàn))進(jìn)行分離培養(yǎng)，在妊娠32周的時候?qū)⒖偭?.5×106、存活率90%的MSCs經(jīng)臍靜脈穿刺注射到胎兒體內(nèi)。妊娠35周時發(fā)生胎膜早破，后經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩一女嬰，出生體重1669g，身長位于-3SD，頭圍位于-2.5SD，有著典型的OI外觀(前額突出、顱骨軟、胸廓不對稱等)，X線顯示骨質(zhì)減少，多處陳舊性骨折及股骨新發(fā)骨折，經(jīng)治療后3周出院；4個月的時候因脊柱壓縮性骨折開始使用二磷酸鹽治療；隨后的2年內(nèi)只發(fā)生過2次可疑骨折，1次因跌落導(dǎo)致的骨折，患兒的身高和體重沿-5SD生長曲線生長；但是到6～8歲時身高生長速度減慢，骨折次數(shù)也增多，因此在8歲2個月的時候患兒接受了第二次MSCs注射(2.8×106個/kg，MSCs來自于同一產(chǎn)前捐獻(xiàn)的胎兒肝臟)，隨后的2年該患兒沒有發(fā)生過骨折，生長曲線從-6.5 SD升至-6 SD，骨質(zhì)也在增加；在10、12、13歲的時候又分別接受了支持劑量的MSCs注射(均來自與產(chǎn)前相同的捐獻(xiàn)肝臟)，未再發(fā)生骨折，生長情況也在持續(xù)改善。在整個治療過程中均沒有發(fā)生免疫反應(yīng)，這可能跟在宮內(nèi)就建立了免疫耐受有關(guān)。該患兒經(jīng)基因檢測被診斷為OI Ⅲ型患者。

另一名OI Ⅳ型患兒來自新加坡，他接受了與上述患兒類似的治療過程，在產(chǎn)前31周時注射總量為40×106的MSCs，出生后1個月因骨質(zhì)減少開始使用二磷酸鹽治療，直至1歲無新發(fā)骨折，并沿生長曲線生長(第3百分位數(shù))，后因生長出現(xiàn)平臺期，在1歲7個月的時候補(bǔ)充注射MSCs(10×106個/kg)，之后繼續(xù)生長并開始走路。

就目前的研究成果來看，產(chǎn)前產(chǎn)后聯(lián)合使用MSCs治療非致死型OI是安全且有一定效果的，除前述2個病例外，仍有尚未報道的治療病例[28]，其確切的治療效果及遠(yuǎn)期并發(fā)癥還需要更多的臨床研究進(jìn)行探索。

宮內(nèi)干細(xì)胞治療雖取得進(jìn)步，并不能針對病因徹底治愈OI，最根本的辦法是基因治療?；蛑委熓峭ㄟ^分子生物學(xué)技術(shù)將正常基因或有治療作用的基因整合到人體相應(yīng)靶細(xì)胞，用以糾正因基因突變等造成的基因缺陷，最終達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委煼譃閮煞N：生殖細(xì)胞基因治療和體細(xì)胞基因治療。就目前的法律只允許對人體進(jìn)行體細(xì)胞基因治療[41]。對胎兒進(jìn)行宮內(nèi)基因治療(in utero gene therapy，IUGT)的方式有兩種，一種為將攜帶正?；虻妮d體輸入到胎兒的臍血，羊膜腔或臟器內(nèi)，常用的載體有病毒和非病毒載體；另一種為在體外將載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至胎兒有缺陷的細(xì)胞后，回輸至體內(nèi)，根據(jù)不同的疾病選擇不同的靶細(xì)胞，最常用的為造血干細(xì)胞，用于治療血液系統(tǒng)疾病等[42,43]。

對于最常見OI類型的基因治療方案為使突變的COL1A1和COL1A2等位基因沉默表達(dá)，以糾正患者細(xì)胞內(nèi)突變的等位基因，隨后將細(xì)胞回輸給患者。目前主要進(jìn)行的是體外試驗(yàn)，尚未見宮內(nèi)治療相關(guān)試驗(yàn)的報道。David等將MSCs從OI患者的細(xì)胞中分離出來，并通過腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)使突變的膠原基因失活，得到誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)，并擴(kuò)增分化成間充質(zhì)干細(xì)胞，此類細(xì)胞在小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生正常的膠原蛋白并形成骨[44]。另外一項(xiàng)研究利用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA使突變的COL1A1等位基因特異性沉默，在Brtl+/-小鼠的纖維母細(xì)胞中減少了40%的突變膠原蛋白表達(dá)[45]。類似的研究結(jié)果表明基因沉默對減少OI的主要突變基因在mRNA水平的表達(dá)有一定的作用[46-48]，對治療OI有著巨大的潛力，但隨之而來的問題和挑戰(zhàn)也越來越多，具體表型如何；若應(yīng)用于宮內(nèi)治療，是否會對胎兒器官發(fā)育，生殖細(xì)胞產(chǎn)生影響[49]；另外由于導(dǎo)致OI的基因突變類型較多，日后會有更多新的基因被發(fā)現(xiàn)，也需要制定個性化的治療方案。在解決了諸多有關(guān)安全性、有效性和倫理問題后，IUGT治療OI才能被應(yīng)用于臨床。

綜上所述，OI的致病基因多樣，表型也不盡相同，通過超聲影像學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)可為OI患兒父母提供更好的遺傳咨詢，MSCs對OI的產(chǎn)前治療雖然取得了一定的效果，仍需要大量的臨床數(shù)據(jù)支持，而IUGT治療OI尚處于初始研究階段，仍有很多問題亟需解決。隨著科學(xué)的進(jìn)步，相信會有更多更成熟的治療方案應(yīng)用于產(chǎn)前治療。