成晨 楊穎 王衛(wèi)云 陳芳 黃慧 楊帆 陳欣林* 郭健*

(1 湖北省婦幼保健院，湖北 武漢 430070;2深圳華大生命科學研究院，廣東 深圳 518083)

先天性唇腭裂(包括腭裂)是人類最常見的先天出生缺陷，每500～1000例新生兒中就有1例是唇腭裂[1]。遺傳和流行病學研究表明了唇腭裂是一個多因素的疾病，遺傳模式很復雜，遺傳和環(huán)境因素都會導致疾病風險[2]。從胚胎發(fā)生學來看，唇腭裂的類型包括4種，單純唇腭裂、唇腭裂合并其他系統(tǒng)畸形、單純唇裂、唇裂合并其他系統(tǒng)畸形?？傮w來說，亞洲和美洲印第安人的出生患病率最高，在不同人群中的易感位點可能有所不同，然而，最近的流行病學資料表明，唇裂可能具有獨特的病因特征，包括很強的遺傳相關性[3]。本研究對142名唇腭裂胎兒的染色體數(shù)目異常以及拷貝數(shù)變異進行分析，探討其臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 對象 2014年1月至2017年12月在湖北省婦幼保健院就診，胎兒超聲提示唇裂或唇腭裂的孕婦，知情同意自愿留取活產(chǎn)胎兒的臍帶或引產(chǎn)胎兒的大腿肌肉組織樣本進行全基因組測序(whole-genome sequencing，WGS)的142例孕婦。孕婦年齡分布為21～41歲，孕周為12～35周。

1.2 方法

1.2.1 儀器使用 德國Siemens S2000彩色多普勒超聲診斷儀，相控陣腹部6C2 探頭，頻率3～5MHz，韓國Samsung WS80，探頭頻率6～10MHz，篩查胎兒各系統(tǒng)。

1.2.2 測序 ①提取胎兒DNA：DNA提取試劑盒由QIAGEN公司生產(chǎn)；②全基因組測序：使用華大基因BGISEQ-500測序平臺對收集的樣本進行低深度WGS以檢測染色體數(shù)目異常以及大于100kb以上的拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV)。

2 結果

2.1 一般情況 142例胎兒中，男性94例，女性48例，男女比例為1∶0.51。孕婦的年齡分布和孕周分布見圖1。單純唇裂、單純唇腭裂合并其他系統(tǒng)畸形的分類及數(shù)目情況見圖2。唇裂與唇腭裂合并畸形涉及的疾病種類見表1。

圖1 收集的142例唇腭裂胎兒例本的孕婦信息a.孕婦年齡(歲)分布情況；b.孕周分布情況

圖2 單純唇裂、單純唇腭裂及合并其他系統(tǒng)畸形情況未檢出染色體數(shù)目異?；蛑虏⌒訡NVs病例可進行高深度的基因組測序分析

2.2 低深度全基因組測序檢出唇腭裂胎兒的情況 單純性唇裂和合并唇腭裂染色體及CNV情況見表2，唇腭裂合并畸形的染色體及CNV情況見表3。

表1 唇裂與唇腭裂及合并畸形情況

表2 單純性唇裂和單獨性唇腭裂染色體及CNV情況

表3 唇腭裂合并畸形的染色體及CNV情況

2.3 檢出致病性CNV的陽性病例 在患者中所檢出致病性CNV的具體情況見下表4。

3 討論

唇腭裂是一種多基因參與的遺傳病， 并且伴有環(huán)境因素的影響。唇腭裂與許多因素相關，比如唇腭裂家族遺傳史，主/被動吸煙，飲酒等不良生活習慣，孕早期患病和用藥，孕婦葉酸服用不足，感染史，孕婦早期精神壓力大等[4-6]。因此，產(chǎn)前診斷胎兒唇腭裂具有非常重要的意義。找到該病的遺傳原因，了解該病的發(fā)病機制。

表4 檢出致病性CNV的陽性病例

本研究利用低深度全基因組測序技術手段對唇腭裂胎兒進行了測序。我們選取了大樣本量唇腭裂胎兒樣本，并對其進行了系統(tǒng)而精準的分類與統(tǒng)計。在我們142例胎兒中，女性胎兒唇腭裂發(fā)生率低于男性胎兒，男女比例為1∶0.51。根據(jù)唇腭裂的類型，我們對唇腭裂胎兒樣本進行了分類，包括單純唇裂、唇裂合并其他系統(tǒng)畸形情況；單純唇腭裂、唇腭裂及合并其他系統(tǒng)畸形情況。單純性唇腭裂發(fā)生率最高，占總數(shù)的59%(84/142)，其次依次是唇腭裂及合并其他系統(tǒng)畸形，占比22%(31/142)、單純唇裂占比10%(14/142)、唇裂及合并其他系統(tǒng)畸形占比9%(13/142)。我們發(fā)現(xiàn)，唇裂和唇腭裂伴發(fā)其他系統(tǒng)畸形情況的病種排名幾乎是一致的。與唇腭裂合并出現(xiàn)的系統(tǒng)畸形種類高達12種。唇裂和唇腭裂伴發(fā)其他系統(tǒng)畸形情況的病種發(fā)生率最高的3個病種依次是神經(jīng)系統(tǒng)畸形、先天性心臟病和其他顏面異常。因此，當我們遇到唇腭裂的病例時，應留心是否有其他系統(tǒng)的畸形，尤其關注神經(jīng)系統(tǒng)畸形、先天性心臟病和其他顏面異常。

142例胎兒中，單純性唇腭裂胎兒共98例(69%，98/142)，唇腭裂合并其他系統(tǒng)畸形胎兒總共42例(31%，44/142)。唇腭裂合并其他系統(tǒng)畸形的發(fā)生率低于單純性唇腭裂。98例唇腭裂胎兒中，未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常，其中7例檢出致病性CNVs(7%，7/98)，提示我們對于單純性唇腭裂胎兒，只進行染色體遺傳檢查，可能會漏檢，應重視對CNV的檢查。而對于42例唇腭裂合并其他系統(tǒng)畸形胎兒，有13例染色體異常，占比31%(13/42)，5例胎兒檢出致病性CNV，占比12%(5/42)。對于這類胎兒，臨床中應首先注重對染色體異常的檢查，其次關注CNV異常。總體而言，陽性診斷率為17.6%(25/142)，我們總共發(fā)現(xiàn)了13例染色體異常，占總例本數(shù)的9.2%(13/142)，而12例胎兒致病性CNV的檢出，增加了8.4%的診斷率(12/142)。從病因?qū)W出發(fā)，對唇腭裂胎兒行單純的染色體檢查是有局限性的，需要增加CNV的檢查以提高總檢出率。

傳統(tǒng)的染色體核型檢查，也就是G-顯帶檢查，是目前常用的方法，可檢查大片段的染色體數(shù)目異常，包括非整倍體和三倍體。近年來，染色體微陣列分析技術(chromosomal microarray analysis，CMA)也成為常見的產(chǎn)前出生缺陷篩查的遺產(chǎn)學檢測手段，該方法能檢測出染色體結構異常，包括染色體微缺失和微重復。隨著遺傳檢測手段的不斷更新，更多的遺傳學檢測手段投入到對唇腭裂的研究當中。周仁等[7]利用二代測序數(shù)據(jù)探索發(fā)現(xiàn)SPRY基因家族中的單核苷酸多態(tài)性與中國人群非綜合征型唇腭裂的發(fā)病風險存在關聯(lián),但未發(fā)現(xiàn)該家族具有親源效應。彭莉等[8]通過二代測序進行基因型分型染色10q25區(qū)域的rs7078160和rs4752028位點與中國人群非綜合征性唇腭裂的發(fā)病相關?；谌蚪M連鎖分析發(fā)現(xiàn)了包括TOX3和COL21A1基因在內(nèi)的4p15.2-p16.1、6p11.2-p12.3、14q13-q21，和16 q12.1這4個不同的位點，這兩個基因的CNV低拷貝增加了唇腭裂的風險[9]。Yu等[10]通過全基因組關聯(lián)分析找到兩個大人群隊列的6個唇腭裂的新易感位點，包括1p36、2p21、3p11.1、8q21.3、13q31.1和15q22，14個新的關聯(lián)基因座(RAD54B、TMEM19、KRT18、WNT9B、GSC/DICER1、PTCH1、RPS26、OFCC1/TFAP2A、TAF1B、FGF10、MSX1、LINC00640、FGFR1和SPRY1)。與以上常規(guī)方法不同，我們的研究嘗試采用了全基因組低深度分析，對142例胎兒例本進行了分析，總診斷率在17.6%。對于142例胎兒樣本中的大多數(shù)CNV陰性例本，我們將再通過高深度測序探索單個堿基水平的改變，并擴大樣本量，擬找到更多的唇腭裂的基因突變和de novo突變，以揭示更多唇腭裂發(fā)生的遺傳學基礎，幫助產(chǎn)前唇腭裂出生缺陷的篩查和產(chǎn)前診斷。