周偉寧 杜倩怡 鐘志成 何天文 張艷霞 唐純芳

(1.廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442；2.廣東省婦幼保健院新生兒外科，廣東 廣州 511442)

染色體異常是導(dǎo)致出生缺陷最常見(jiàn)的遺傳病之一，新生兒各種染色體異常的發(fā)生率約為1/160，主要包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常，其中數(shù)目異常更為常見(jiàn)[1]。常見(jiàn)的5條染色體數(shù)目異常包括21、18、13、X、Y，引起了80%～90%以上的有臨床重大意義的染色體疾病[2,3]。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展，社會(huì)的科普及孕婦對(duì)其認(rèn)識(shí)度的提高，診斷染色體數(shù)目異常的技術(shù)已在臨床上得到普遍的應(yīng)用，傳統(tǒng)的染色體核型技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用了很多年了，其金標(biāo)準(zhǔn)的地位至今沒(méi)被取代，但其報(bào)告周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)受環(huán)境影響大，有一定的失敗率，孕婦及家屬心情非常焦慮，不利于孕期健康，甚至可能引起醫(yī)患矛盾[4]。因此，一項(xiàng)快速穩(wěn)定的檢測(cè)技術(shù)對(duì)染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷非常具有臨床價(jià)值。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR)技術(shù)利用熒光引物對(duì)染色體上特異的多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)毛細(xì)管電泳，用熒光變量雙峰的比值對(duì)染色體數(shù)目進(jìn)行判斷，這種技術(shù)方法具備快速、方便、成本低、通量高等優(yōu)點(diǎn)，而且還能進(jìn)行污染鑒定，在國(guó)內(nèi)外一些大型的產(chǎn)前診斷機(jī)構(gòu)得到了廣泛的應(yīng)用[5-7]，這一技術(shù)在報(bào)告周期上比核型分析具有較大的優(yōu)勢(shì)[8]。很多孕婦對(duì)篩查高風(fēng)險(xiǎn)非常的恐懼，QF-PCR能在48小時(shí)內(nèi)出結(jié)果，結(jié)果陰性就基本排除了80%以上的染色體疾病，可以減輕孕婦的心理負(fù)擔(dān)，對(duì)孕期檢查有很大的指導(dǎo)作用。我們實(shí)驗(yàn)室的QF-PCR選擇雜合度高的STR位點(diǎn)比一般實(shí)驗(yàn)室多，共24個(gè)，那準(zhǔn)確率有多高呢？會(huì)不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性？本研究收集了產(chǎn)前診斷的病例標(biāo)本4262例，將病例標(biāo)本用QF-PCR和染色體核型分析兩種方法檢測(cè)后的結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)估QF-PCR技術(shù)在大數(shù)據(jù)支持下的靈敏度和特異度，深入探討QF-PCR在染色體非整倍體產(chǎn)前診斷應(yīng)用中的能力。另外，需要進(jìn)行QF-PCR檢測(cè)的原因有好幾種，我們統(tǒng)計(jì)染色體非整倍體在不同的產(chǎn)前診斷指征中的陽(yáng)性率，了解數(shù)據(jù)對(duì)臨床咨詢(xún)的參考意義。

1 資料與方法

1.1 基本資料 收集2018年1月1日至2018年12月30日在廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心門(mén)診進(jìn)行產(chǎn)前診斷的高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的標(biāo)本，并用QF-PCR共成功檢測(cè)4262例，染色體核型分析成功檢測(cè)4254例，8例培養(yǎng)失敗。高風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)包括孕婦年齡≥35歲、唐氏綜合征血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查高風(fēng)險(xiǎn)、超聲軟指標(biāo)異常、染色體異常兒生育史等。

1.2 方法 所有進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦都簽署知情同意書(shū)，絨毛穿刺在11～14周，羊水穿刺在16～24周，臍血穿刺在24周之后。絨毛標(biāo)本210例，羊水標(biāo)本3940例，臍血標(biāo)本112例。羊水標(biāo)本采集20ml，其中15ml用于核型分析，5ml用于QF-PCR；臍血標(biāo)本2ml，1.5 ml用于核型分析，0.5 ml用于QF-PCR。

1.2.1 染色體核型分析 核型分析首先按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，制片G顯帶，參照 ISCN(2009)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。

1.2.2 QF-PCR

1.2.2.1 DNA提取預(yù)處理 ①絨毛：在顯微鏡下挑取絨毛2根，用生理鹽水清洗后加入蛋白酶K和ATL組織裂解液200μl，56℃水浴5～10分鐘直到組織溶解；②羊水：2200rpm/min離心10min，去上清留細(xì)胞液200μl；③臍血：混勻后取200μl。

1.2.2.2 采用QIAGEN試劑盒對(duì)預(yù)處理的標(biāo)本按照說(shuō)明書(shū)提取步驟進(jìn)行處理。

1.2.2.3 引物合成 引物設(shè)計(jì)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取5條染色體中24個(gè)多態(tài)位點(diǎn)作為引物序列。13號(hào)染色體位點(diǎn)4個(gè)：D13S305、D13S628、D13S634 和 D13S742；18號(hào)染色體位點(diǎn)5個(gè)：D18S978、D18S386、D18S391、D18S535 和 D18S1002；21號(hào)染色體位點(diǎn)7個(gè)：D21S1411、D21S1412、D21S1414、D21S11、D21S2039、D21S1435、D21S1437，性染色體的STR位點(diǎn)8個(gè)：AMEL、SRY、DXS7423、X22、DXS1187、DXS981、DXYS218、DYS448。檢測(cè)位點(diǎn)的引物上游5’端采用不同熒光標(biāo)記，引物的合成和標(biāo)記由TAKARA公司完成。

1.2.2.4 擴(kuò)增 ①TAKARA公司的PCR反應(yīng)混合液25μl，引物7.5μl，DNA模板5μl，總體積25ul。使用ABI9700PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增。②反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min后，94℃變性 30s，最適退火溫度保溫30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸60min，置4℃保存。

1.2.2.5 毛細(xì)管電泳檢測(cè) ①取9μl的上樣液(甲酰胺8.6μl加分子內(nèi)標(biāo)internal lane standard 600 0.4ul)和1μl PCR產(chǎn)物混合；②PCR儀器95℃變性5min后放冰上5min；③ABI 3500測(cè)序儀采用POP-4凝膠進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.2.2.6 結(jié)果分析 ①將電泳數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入軟件Gene Scan3.7進(jìn)行分析。②根據(jù)國(guó)際公認(rèn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)(ACC/CMGS)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。正常：STR位點(diǎn)兩個(gè)等位基因熒光信號(hào)峰面積比例在0.8～1.4之間。三體：STR位點(diǎn)等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后呈現(xiàn)3個(gè)熒光峰，峰面積的比例約為1∶1∶1；呈現(xiàn)的是雙峰，比例>1.8或<0.65。如果STR位點(diǎn)的等位基因呈現(xiàn)的是單峰，認(rèn)為是無(wú)效峰，每一條染色體必須要有兩個(gè)以上STR位點(diǎn)異常才能判斷為異常。

2 結(jié)果

2.1 QF-PCR檢測(cè)結(jié)果 成功檢測(cè)總例數(shù)4262例，正常3957例，占總例數(shù)92.8%，陽(yáng)性數(shù)是305例，陽(yáng)性率為7.2%，其中21-三體184例，占總陽(yáng)性例數(shù)的60.3%，18-三體62例(20.3%)，13-三體24例(7.9%)，X單體12例(3.9%),XXY10例(3.3%)，XYY6例(2.0%)，XXYY2例(0.7%)，21-三體嵌合體3例(1.0%)，X/XX嵌合體2例(0.7%)。

2.2 染色體核型分析結(jié)果 送檢標(biāo)本4262例，成功檢測(cè)4254例，其中有8例培養(yǎng)失敗，成功率99.8%。在成功檢測(cè)的4254例標(biāo)本中，結(jié)果正常有3900例，占91.7%。陽(yáng)性標(biāo)本354(8.3%)，其中包括非整倍體300例(21-三體184例，18-三體62例，13-三體24例，X單體12例，XXY 10例，XYY 6例，XXYY2例)，46例結(jié)構(gòu)異常和8例嵌合體。

2.3 兩種方法驗(yàn)證對(duì)比 4262例QF-PCR檢測(cè)標(biāo)本用染色體核型分析金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證，其中8例培養(yǎng)失敗，這8例標(biāo)本用QF-PCR檢測(cè)為陰性。將兩種方法都成功地對(duì)4254例標(biāo)本進(jìn)行比較，304例非整倍體符合。結(jié)構(gòu)異常共46例，不在QF-PCR 的檢測(cè)范圍內(nèi)。核型分析檢測(cè)出的8例嵌合體中，QF-PCR只檢測(cè)出4例，漏診率達(dá)50%。有1例嵌合體QF-PCR檢測(cè)陽(yáng)性，而核型分析是陰性(表1)。以染色體核型分析作為檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，QF-PCR技術(shù)的靈敏度為85.9%，特異度為99.9%(表2)。把結(jié)構(gòu)異常等不在檢測(cè)范圍內(nèi)的標(biāo)本剔除后的靈敏度和特異度分別為98.7%和99.9%(表3)。

2.4 不同產(chǎn)前診斷指征的染色體非整倍體的陽(yáng)性率 根據(jù)這些孕婦的就診病歷，按最主要的產(chǎn)前診斷指征，我們大概分為以下常見(jiàn)幾類(lèi)，①唐氏綜合征篩查高風(fēng)險(xiǎn)；②無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查高風(fēng)險(xiǎn)；③胎兒超聲異常包括發(fā)育遲緩、腦室增寬、唇腭裂、羊水過(guò)多、羊水過(guò)少、心臟異常，臍血流異常等；④頸項(xiàng)透明層厚度(nuchal translucecy， NT)增厚； ⑤不良孕產(chǎn)史包括生育過(guò)唐氏患兒，胎死宮內(nèi)等；⑥孕婦年齡≥35歲等等，筆者嘗試對(duì)這些常見(jiàn)的高風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)最終診斷為染色體非整倍體的陽(yáng)性率進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，詳細(xì)見(jiàn)表4。

表1 4262例樣本產(chǎn)前診斷結(jié)果對(duì)比

表2 統(tǒng)計(jì)QF-PCR的靈敏度和特異度(例)

注：靈敏度=304/(304+50)×100%=85.9% ，特異度=3899/(1+3899)×100%=99.9%；+表示檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；-表示檢測(cè)結(jié)果陰性。

表3 統(tǒng)計(jì)QF-PCR的靈敏度和特異度(例)

注：靈敏度=304/(304+4)×100%=98.7% ；特異度=3899/(1+3899)×100%=99.9%；+表示檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；-表示檢測(cè)結(jié)果陰性。

表4 不同產(chǎn)前診斷指征的染色體非整倍體的陽(yáng)性率(例)

3 討論

大家都清楚染色體非整倍體疾病是一種危害非常嚴(yán)重的常見(jiàn)遺傳病，其主要臨床表現(xiàn)是發(fā)育遲緩，智力低下，多發(fā)畸形，甚至致死致殘，給家庭帶來(lái)沉重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9]。到目前為止預(yù)防染色體非整倍體患兒的出生目前主要還是對(duì)孕婦進(jìn)行唐氏綜合征血清學(xué)的篩查，高風(fēng)險(xiǎn)再進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查或產(chǎn)前診斷。染色體核型分析準(zhǔn)確率高，金標(biāo)準(zhǔn)的地位依然未能動(dòng)搖，但報(bào)告周期太長(zhǎng)，孕婦及家屬都會(huì)非常擔(dān)心，而且標(biāo)本需要培養(yǎng)，容易受環(huán)境影響，有一定的失敗率，容易引起醫(yī)患矛盾，這些都是染色體核型分析不可避免的缺點(diǎn)[10]。QF-PCR技術(shù)對(duì)標(biāo)本要求較低，量要求較少，不需要培養(yǎng)，只要對(duì)標(biāo)本提取DNA即可，失敗率低，48小時(shí)內(nèi)就能出報(bào)告，其非常重要一點(diǎn)是能夠?qū)Ξa(chǎn)前診斷標(biāo)本進(jìn)行母血污染鑒定，這是很多方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)[11]。QF-PCR同時(shí)也存在缺點(diǎn)，不能取代染色體核型分析單獨(dú)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，如只能檢測(cè)常見(jiàn)的5條染色體數(shù)目異常，不能檢測(cè)結(jié)構(gòu)異常，嵌合體和少數(shù)性染色體異常診斷會(huì)比較困難[12-13]，QF-PCR在產(chǎn)前診斷方面的診斷價(jià)值早期就有些文獻(xiàn)報(bào)道，但數(shù)據(jù)都不是很大，QF-PCR靈敏度和特異度沒(méi)有大數(shù)據(jù)的支持，對(duì)于一些嵌合體的檢出率就更少了，而我們采用的STR位點(diǎn)非常多，雜合度高，在診斷方面更加的容易[14]。

本研究收集了1年的標(biāo)本病例，回顧性分析了4262例QF-PCR產(chǎn)前診斷的標(biāo)本，并每一例標(biāo)本都和染色體核型結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)：①核型分析有8例標(biāo)本培養(yǎng)失敗，這8例標(biāo)本QF-PCR都檢測(cè)出來(lái)了，結(jié)果是陰性的，QF-PCR技術(shù)和染色體核型分析技術(shù)在常見(jiàn)5條染色體(13、18、21、X、Y)非整倍體的診斷符合率達(dá)98.8%。②核型分析發(fā)現(xiàn)8例嵌合體而QF-PCR只檢測(cè)出4例，對(duì)于高比例的嵌合如30%以上，QF-PCR能起到提示作用，對(duì)于低比例的嵌合，QF-PCR技術(shù)也無(wú)能為力，這些觀點(diǎn)某些文獻(xiàn)已有報(bào)道[15]。而值得一提的是其中有1例標(biāo)本QF-PCR提示是21-三體嵌合體，而染色體核型分析并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常，最后用FISH技術(shù)也檢測(cè)出約35%比例的嵌合，對(duì)于比例并不低的三體嵌合核型分析未檢出的原因科室也做了討論，考慮羊水細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，異常細(xì)胞被淘汰的可能，因此，染色體核型分析和QF-PCR結(jié)果不符合，需要第三技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，不能完全依靠核型分析做診斷。③參照染色體核型分析作為金標(biāo)準(zhǔn)，QF-PCR檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和特異度的是85.9%和99.9%，如果剔除結(jié)構(gòu)異常等不在QF-PCR檢測(cè)范圍內(nèi)的標(biāo)本，在常見(jiàn)5條染色體(13、18、21、X、Y)非整倍體的檢測(cè)范圍內(nèi)靈敏度和特異度分別為98.7%和 99.9%。

孕婦年齡≥35歲(高齡)、胎兒頸項(xiàng)透明層增厚、唐氏綜合征血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)，這些都是發(fā)生染色體非整倍體的高風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)，也是比較常見(jiàn)的產(chǎn)前診斷指征，除此之外，胎兒超聲異常、不良孕產(chǎn)史等臨床上都會(huì)建議行QF-PCR，核型分析，全基因組芯片分析等方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷，不同的指征最后診斷為(13、18、21、X、Y)非整倍體的陽(yáng)性率究竟有多高，甚少文獻(xiàn)報(bào)道，這對(duì)于臨床醫(yī)生的遺傳咨詢(xún)也有一定的指導(dǎo)價(jià)值，經(jīng)過(guò)分類(lèi)匯總發(fā)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查高風(fēng)險(xiǎn)陽(yáng)性率最高，達(dá)到77.6%，其次是胎兒頸項(xiàng)透明層增厚、胎兒超聲異常、唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)，陽(yáng)性率在8%～10%，高齡陽(yáng)性率4.4%。高危妊娠、不良孕產(chǎn)史陽(yáng)性率較低，分別為3.9%和1.0%，雙親染色體異常、IVF陽(yáng)性率為零，這樣分類(lèi)的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性暫時(shí)沒(méi)有找到文獻(xiàn)的支持，但結(jié)果和我們的共識(shí)也很接近。

綜上所述，QF-PCR技術(shù)在48小時(shí)內(nèi)能成功地對(duì)常見(jiàn)5條染色體(13、18、21、X、Y)非整倍體進(jìn)行快速診斷，靈敏度，特異度和成功率高，在低比例的嵌合體非常容易漏診，但它也能發(fā)現(xiàn)核型分析因培養(yǎng)因素漏診的嵌合體，因此，染色體核型分析和QF-PCR結(jié)果不符合，需要第三技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，不能完全依靠核型分析作診斷。另外關(guān)于不同產(chǎn)前診斷指征最終診斷為常見(jiàn)5種染色體非整倍體的陽(yáng)性率，對(duì)臨床醫(yī)生遺傳咨詢(xún)有一定的參考價(jià)值。