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        殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的制備及免疫效果評(píng)價(jià)

        2020-05-21 08:25:12何亞鵬時(shí)曉李博魏凱杜迎春
        水產(chǎn)養(yǎng)殖 2020年4期
        關(guān)鍵詞:弗氏亞種佐劑

        何亞鵬,時(shí)曉,李博,魏凱,杜迎春

        (北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心,北京 102100)

        殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida,As)屬于氣單胞菌屬,形態(tài)為短桿菌,革蘭氏染色陰性,其在淡水與海水環(huán)境中廣泛存在,之前研究認(rèn)為其不能在37℃生長(zhǎng),是嗜冷無(wú)動(dòng)力型氣單胞菌,但近期的一些山羊和人類的病例表明其可能為人-畜-魚共患病原菌。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)亞種,即典型亞種1種(殺鮭亞種),不典型亞種4種(無(wú)色亞種、殺日本鮭亞種、產(chǎn)果膠亞種及史氏亞種)。該菌最早由德國(guó)發(fā)現(xiàn),歐洲、美洲、亞洲和非洲均有分布,是世界性的咸淡水養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌,主要引起16種鮭鱒魚類如各類大馬哈魚、細(xì)鱗鮭、大西洋鮭、虹鱒和河鱒等鮭鱒魚癤瘡病及潰瘍病,死亡率高;其宿主范圍也在不斷擴(kuò)大,有引起金魚、鯉魚等鯉科魚類的潰瘍病和紅皮炎的報(bào)道,最近研究發(fā)現(xiàn)還可感染七鰓鰻科和鮨科魚類,如果任其流行蔓延不僅會(huì)危害我國(guó)鮭鱒魚、鯉科魚類等養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,還會(huì)進(jìn)一步威脅珍稀鮭鱒魚物種的生存,影響其救護(hù)和繁育工作的開展。針對(duì)我國(guó)冷水魚養(yǎng)殖和救護(hù)中癤瘡病及潰瘍病常發(fā)且危害嚴(yán)重的現(xiàn)狀,該研究制備殺鮭氣單胞菌滅活疫苗,進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)試驗(yàn),取得了較好的結(jié)果。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)魚

        試驗(yàn)用的細(xì)鱗鮭采集自本單位養(yǎng)殖區(qū),由實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)。細(xì)鱗鮭體長(zhǎng)為12 cm左右,體質(zhì)量為10 g左右,魚體體色正常、體表無(wú)損傷。試驗(yàn)前放于室內(nèi)試驗(yàn)箱中暫養(yǎng)2周,水溫控制在14℃左右,每天投喂2次商品化冷水魚飼料。

        1.2 菌種來(lái)源

        殺鮭氣單胞菌由北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心分離自患疥瘡病魚并保存[1]。

        1.3 滅活疫苗的制備

        取凍存的的殺鮭氣單胞菌,接種于普通瓊脂培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng)18 h后,觀察菌落正常。挑取單菌落接種于5 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中25℃、200 mg/L震蕩培養(yǎng)24 h。向已制備好的菌液中加入適量甲醛(終濃度為0.3%),37℃恒溫滅活48 h,涂板檢驗(yàn)無(wú)活菌后,菌液離心收集菌體,用PBS洗滌菌體4次,洗去菌體中殘留的甲醛,最后將菌體用無(wú)菌PBS稀釋,分別加入適量不同佐劑,即制得殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗。采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌濃度為2.0×108CFU/mL,取弗氏佐劑與等量滅活菌懸液分別吸入2個(gè)注射器內(nèi),排凈空氣,2個(gè)注射器之間以三通連接器相連,然后交替推動(dòng)針管,進(jìn)行疫苗乳化,直至形成粘稠的乳劑,即為弗氏佐劑疫苗[2]。

        1.4 免疫接種和血液采集

        將細(xì)鱗鮭分為A、B、C三組,將濃度為1.0×108CFU/mL的弗氏佐劑疫苗、不加佐劑全菌滅活疫苗及PBS,采用腹腔注射方式分別進(jìn)行免疫細(xì)鱗鮭,A組為弗氏佐劑疫苗,B組為不加佐劑全菌滅活疫苗,C組為PBS,每尾200 μl,觀察1周內(nèi)魚的健康狀況及存活情況,進(jìn)行疫苗的安全性檢驗(yàn)。確定疫苗安全后,同樣的方法將試驗(yàn)魚分別免疫,于第1 d和注射后第7、14、21、28和 35 d 采血。每組隨機(jī)取 5 尾,尾柄靜/動(dòng)脈采血,收集血清備用。

        1.5 抗體效價(jià)測(cè)定

        采用傳統(tǒng)的試管凝集法檢測(cè)血清抗體水平,觀察細(xì)菌的凝集程度,計(jì)算每組的平均值,作為結(jié)果[3]。

        1.6 免疫保護(hù)率測(cè)定

        進(jìn)行免疫28 d后,各組魚隨機(jī)取30尾,腹腔注射0.1 mL殺鮭氣單胞菌活菌液(1.0×108CFU/mL)進(jìn)行攻毒試驗(yàn),觀察記錄12 d內(nèi)的死亡情況。根據(jù)公式計(jì)算免疫保護(hù)率(Relative percent survival,RPS)∶RPS=[1-(免疫組死亡率/對(duì)照組病死率)]×100%[4]。

        2 結(jié)果

        2.1 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

        方法1.5中試管凝集法測(cè)得試驗(yàn)組的抗體效價(jià)呈上升趨勢(shì),弗氏佐劑組血清平均抗體效價(jià)在第1~28 d逐步上升,在28 d達(dá)到峰值,為1∶460.8,之后緩慢下降;不加佐劑組血清平均抗體效價(jià)于免疫后呈上升趨勢(shì),在21 d達(dá)到峰值,為1∶281.6,之后緩慢下降;對(duì)照組無(wú)變化。

        2.2 免疫保護(hù)率檢測(cè)結(jié)果

        免疫28 d后,各免疫組和對(duì)照組細(xì)鱗鮭的累計(jì)死亡數(shù)見(jiàn)圖2。統(tǒng)計(jì)攻毒10 d后,弗氏佐劑組、不加佐劑組和對(duì)照組細(xì)鱗鮭的病死率分別為為13.3%、20%和76.7%,根據(jù)公式計(jì)算得出弗氏佐劑組和不加佐劑組的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為82.7%和73.9%(表 2)。

        表1 各免疫組魚血清凝集抗體效價(jià)的檢測(cè)

        圖1 活菌攻毒后各組的累計(jì)死亡數(shù)

        表2 活菌攻毒后各組的病死率和免疫保護(hù)力

        3 討論

        殺鮭氣單胞菌廣泛存在于水體環(huán)境中,該病原引起的疥瘡病和潰瘍病每年都會(huì)對(duì)相關(guān)行業(yè)造成很大損失,對(duì)冷水魚養(yǎng)殖行業(yè)和珍稀水生動(dòng)物保護(hù)有較大的威脅。魚類疫苗發(fā)展較畜牧獸醫(yī)業(yè)晚,在生產(chǎn)中應(yīng)用的較多的仍是滅活疫苗。該殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的制備試驗(yàn)利用甲醛制備殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最低終濃度為0.3%甲醛可以將菌液完全滅活;免疫后弗氏佐劑組及不加佐劑組細(xì)鱗鮭的血清平均抗體效價(jià)于免疫后呈上升趨勢(shì),弗氏佐劑組的抗體效價(jià)更高。隨后進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明弗氏佐劑全菌滅活疫苗保護(hù)效果可達(dá)到82.7%,弗氏佐劑疫苗可以緩慢的釋放抗原,能夠使細(xì)鱗鮭產(chǎn)生較持久的免疫力,該試驗(yàn)為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用殺鮭氣單胞菌疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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