何亞鵬，時(shí)曉，李博，魏凱，杜迎春

（北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京 102100）

殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida,As）屬于氣單胞菌屬，形態(tài)為短桿菌，革蘭氏染色陰性，其在淡水與海水環(huán)境中廣泛存在，之前研究認(rèn)為其不能在37℃生長(zhǎng)，是嗜冷無(wú)動(dòng)力型氣單胞菌，但近期的一些山羊和人類的病例表明其可能為人-畜-魚(yú)共患病原菌。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)亞種，即典型亞種1種（殺鮭亞種），不典型亞種4種（無(wú)色亞種、殺日本鮭亞種、產(chǎn)果膠亞種及史氏亞種）。該菌最早由德國(guó)發(fā)現(xiàn)，歐洲、美洲、亞洲和非洲均有分布，是世界性的咸淡水養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌，主要引起16種鮭鱒魚(yú)類如各類大馬哈魚(yú)、細(xì)鱗鮭、大西洋鮭、虹鱒和河鱒等鮭鱒魚(yú)癤瘡病及潰瘍病，死亡率高；其宿主范圍也在不斷擴(kuò)大，有引起金魚(yú)、鯉魚(yú)等鯉科魚(yú)類的潰瘍病和紅皮炎的報(bào)道，最近研究發(fā)現(xiàn)還可感染七鰓鰻科和鮨科魚(yú)類，如果任其流行蔓延不僅會(huì)危害我國(guó)鮭鱒魚(yú)、鯉科魚(yú)類等養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，還會(huì)進(jìn)一步威脅珍稀鮭鱒魚(yú)物種的生存，影響其救護(hù)和繁育工作的開(kāi)展。針對(duì)我國(guó)冷水魚(yú)養(yǎng)殖和救護(hù)中癤瘡病及潰瘍病常發(fā)且危害嚴(yán)重的現(xiàn)狀，該研究制備殺鮭氣單胞菌滅活疫苗，進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)，取得了較好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)

試驗(yàn)用的細(xì)鱗鮭采集自本單位養(yǎng)殖區(qū)，由實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)。細(xì)鱗鮭體長(zhǎng)為12 cm左右，體質(zhì)量為10 g左右，魚(yú)體體色正常、體表無(wú)損傷。試驗(yàn)前放于室內(nèi)試驗(yàn)箱中暫養(yǎng)2周，水溫控制在14℃左右，每天投喂2次商品化冷水魚(yú)飼料。

1.2 菌種來(lái)源

殺鮭氣單胞菌由北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心分離自患疥瘡病魚(yú)并保存[1]。

1.3 滅活疫苗的制備

取凍存的的殺鮭氣單胞菌，接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)18 h后，觀察菌落正常。挑取單菌落接種于5 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中25℃、200 mg/L震蕩培養(yǎng)24 h。向已制備好的菌液中加入適量甲醛（終濃度為0.3%），37℃恒溫滅活48 h，涂板檢驗(yàn)無(wú)活菌后，菌液離心收集菌體，用PBS洗滌菌體4次，洗去菌體中殘留的甲醛，最后將菌體用無(wú)菌PBS稀釋，分別加入適量不同佐劑，即制得殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗。采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌濃度為2.0×108CFU/mL，取弗氏佐劑與等量滅活菌懸液分別吸入2個(gè)注射器內(nèi)，排凈空氣，2個(gè)注射器之間以三通連接器相連，然后交替推動(dòng)針管，進(jìn)行疫苗乳化，直至形成粘稠的乳劑，即為弗氏佐劑疫苗[2]。

1.4 免疫接種和血液采集

將細(xì)鱗鮭分為A、B、C三組，將濃度為1.0×108CFU/mL的弗氏佐劑疫苗、不加佐劑全菌滅活疫苗及PBS，采用腹腔注射方式分別進(jìn)行免疫細(xì)鱗鮭，A組為弗氏佐劑疫苗，B組為不加佐劑全菌滅活疫苗，C組為PBS，每尾200 μl，觀察1周內(nèi)魚(yú)的健康狀況及存活情況，進(jìn)行疫苗的安全性檢驗(yàn)。確定疫苗安全后，同樣的方法將試驗(yàn)魚(yú)分別免疫，于第1 d和注射后第7、14、21、28和 35 d 采血。每組隨機(jī)取 5 尾，尾柄靜/動(dòng)脈采血，收集血清備用。

1.5 抗體效價(jià)測(cè)定

采用傳統(tǒng)的試管凝集法檢測(cè)血清抗體水平，觀察細(xì)菌的凝集程度，計(jì)算每組的平均值，作為結(jié)果[3]。

1.6 免疫保護(hù)率測(cè)定

進(jìn)行免疫28 d后，各組魚(yú)隨機(jī)取30尾，腹腔注射0.1 mL殺鮭氣單胞菌活菌液（1.0×108CFU/mL）進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，觀察記錄12 d內(nèi)的死亡情況。根據(jù)公式計(jì)算免疫保護(hù)率（Relative percent survival,RPS）∶RPS=[1－（免疫組死亡率/對(duì)照組病死率）]×100%[4]。

2 結(jié)果

2.1 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

方法1.5中試管凝集法測(cè)得試驗(yàn)組的抗體效價(jià)呈上升趨勢(shì)，弗氏佐劑組血清平均抗體效價(jià)在第1～28 d逐步上升，在28 d達(dá)到峰值，為1∶460.8，之后緩慢下降；不加佐劑組血清平均抗體效價(jià)于免疫后呈上升趨勢(shì)，在21 d達(dá)到峰值，為1∶281.6，之后緩慢下降；對(duì)照組無(wú)變化。

2.2 免疫保護(hù)率檢測(cè)結(jié)果

免疫28 d后，各免疫組和對(duì)照組細(xì)鱗鮭的累計(jì)死亡數(shù)見(jiàn)圖2。統(tǒng)計(jì)攻毒10 d后，弗氏佐劑組、不加佐劑組和對(duì)照組細(xì)鱗鮭的病死率分別為為13.3%、20%和76.7%，根據(jù)公式計(jì)算得出弗氏佐劑組和不加佐劑組的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為82.7%和73.9%（表 2）。

表1 各免疫組魚(yú)血清凝集抗體效價(jià)的檢測(cè)

圖1 活菌攻毒后各組的累計(jì)死亡數(shù)

表2 活菌攻毒后各組的病死率和免疫保護(hù)力

3 討論

殺鮭氣單胞菌廣泛存在于水體環(huán)境中，該病原引起的疥瘡病和潰瘍病每年都會(huì)對(duì)相關(guān)行業(yè)造成很大損失，對(duì)冷水魚(yú)養(yǎng)殖行業(yè)和珍稀水生動(dòng)物保護(hù)有較大的威脅。魚(yú)類疫苗發(fā)展較畜牧獸醫(yī)業(yè)晚，在生產(chǎn)中應(yīng)用的較多的仍是滅活疫苗。該殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的制備試驗(yàn)利用甲醛制備殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最低終濃度為0.3%甲醛可以將菌液完全滅活；免疫后弗氏佐劑組及不加佐劑組細(xì)鱗鮭的血清平均抗體效價(jià)于免疫后呈上升趨勢(shì)，弗氏佐劑組的抗體效價(jià)更高。隨后進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明弗氏佐劑全菌滅活疫苗保護(hù)效果可達(dá)到82.7%，弗氏佐劑疫苗可以緩慢的釋放抗原，能夠使細(xì)鱗鮭產(chǎn)生較持久的免疫力，該試驗(yàn)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用殺鮭氣單胞菌疫苗奠定了基礎(chǔ)。