陳錚潔，吳 菱，胡芳芳，應倩倩，狄亞珍，鐘世玲

(1. 寧波大學醫(yī)學院，浙江 寧波 315000；2. 寧波市婦女兒童醫(yī)院 小兒風濕免疫科, 浙江 寧波 315000；3.寧波市第一醫(yī)院 小兒風濕免疫科，浙江 寧波 315000)

川崎病(kawasaki disease, KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，是主要累及中小型動脈的全身性血管炎，已經取代了風濕熱成為兒童獲得性心臟病的主要病因[1]。靜脈丙種球蛋白(IVIG)是目前大家公認的治療KD的一線藥物，可將動脈瘤的風險從25%～30%，降至5%～7%[2]。據近期統(tǒng)計，IVIG-無效型KD的發(fā)生率呈上升趨勢，并呈現出冠狀動脈損害(coronary artery lesions, CAL)高風險[3]。KD患兒首次IVIG- 治療效果欠佳, 是 KD 急性期治療難點之一。目前KD丙種球蛋白抵抗的機制尚不明確，研究表明可能與遺傳因素、炎性介質的作用(如IL-1β、IL-6等)及T淋巴細胞活化等相關[4-5]。金屬蛋白酶Meprin A是炎癥過程中重要的蛋白水解調節(jié)劑，可將IL-1β前體形式(pro-IL-1β)轉變?yōu)橛猩锘钚缘腎L-1β，引起炎癥及組織損傷[6]。國外研究發(fā)現在冠狀動脈炎小鼠模型的血清中發(fā)現Meprin A的水平顯著升高[7]。因此, 本研究通過比較血清Meprin A、 IL-1β在KD丙種球蛋白使用前后的變化，旨在探討Meprin A、 IL-1β在IVIG-無效型KD中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2016年12月至2019年3月在我院確診的接受IVIG-標準化治療KD患兒410例為試驗組，納入標準：診斷明確且資料完整的KD患兒，診斷標準參考AHA2017[8]。排除標準：合并有其他自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等。另外選取我院同期住院的上呼吸道感染的患兒201例作為對照組，排除自身免疫性疾病、其他感染性疾病、腫瘤等。兩組患兒2周內均未給予激素、免疫抑制劑、IVIG治療。所有試驗組患兒均進行IVIG及阿司匹林治療，根據IVIG治療效果(首劑IVIG-治療36 h，仍持續(xù)發(fā)熱(>38 ℃)，或給藥后熱退2～7 天甚至2周再發(fā)熱，且至少具備l項KD主要表現者，定義為IVIG-無反應)分為IVIG-有效組(355例)和IVIG-無效組(55例)。本研究患兒的家屬均簽署知情同意書及獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，批準號【2018】倫審字(22)。

1.2檢查項目 記錄患兒的年齡、性別、臨床特征以及首劑應用IVIG時間、熱程等，同時記錄實驗室數據包括白細胞計數(WBC)，血紅蛋白(Hb)，血小板計數(PLT)，C反應蛋白(CRP)，紅細胞沉降率(ESR)，丙氨酸轉氨酶(ALT)，白蛋白(ALB)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、NT-proBNP等。所有KD患兒入院時及隨訪8周內檢測心臟彩色超聲共3～4次。根據心臟超聲提示：冠狀動脈擴張或冠狀動脈瘤，定義為冠狀動脈損害(CAL)。

血清Meprin A、IL-1β檢測：所有入組KD患兒在急性期(病程3～7 d)和緩復期(體溫正常癥狀消失，病程2～3周)分別采取空腹靜脈血4 ml，以3 000 r/min速率，離心10 min，分離出血清，保存于-80 ℃冰箱中待檢。對照組患兒入院采集空腹靜脈血2 ml，處理方法與KD組相同。取上述血清，分別使用Meprin A ELISA試劑盒及IL-1β ELISA試劑盒(分別購于BD公司)通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測Meprin A及IL-1β水平。

1.3治療方法 對KD患兒均提供IVIG治療，IVIG-有效組及IVIG-無效組均采用同一公司生產的IVIG(成都蓉生藥業(yè)有限公司，國藥準字S19993042，50 ml：2.5 g/瓶)，同時服用阿司匹林腸溶片(辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H37023270，25 mg/片)：首次治療予IVIG- 2 g/(kg·次)，聯(lián)合阿司匹林30～50 mg/(kg·d)，熱退3 d后阿司匹林減量至3～5 mg/kg。IVIG-無效組：首次治療予IVIG- 2 g/(kg·次)，聯(lián)合阿司匹林30～50 mg/(kg·d)，無效再次予IVIG- 2 g/kg或激素2 mg/kg或IVIG- 2 g/kg加激素2 mg/kg，阿司匹林減量1/3～1/2，熱退3 d后阿司匹林減量至3～5 mg/kg。

2 結 果

2.1KD組與對照組臨床與實驗室特點 410例KD患兒，男性226(55.1%)，中位年齡2歲，最小3月，最大10歲；對照組201例，男性108(53.7%)，中位年齡1.5歲，最小6月，最大10歲，兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。KD患兒急性期WBC、PLT、CRP、ESR、ALT、ALB、HDL-C、NT-proBNP、Meprin A及血清IL-1β水平均顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

2.2KD急性期與緩解期實驗室指標變化 KD患兒急性期WBC、Hb、PLT、CRP、ESR、ALT、ALB、HDL-C、NT-proBNP、Meprin A及血清IL-1β水平均顯著高于緩解期(P<0.01)，見表2。

表1 KD組與對照組臨床特征及實驗室指標比較

表2 KD急性期與緩解期實驗室指標比較(n=410)

2.3IVIG-有效組與無效組臨床和實驗室特點 410例KD患兒中IVIG-有效組355例(86.6%)，男性193例(54.4%)，中位年齡2.4歲；IVIG-無效型型有55例(13.4%)，男性33例(60.0%)，中位年齡2.4歲，兩者之間性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與IVIG-有效組比較，IVIG-無效組首劑應用IVIG時間、熱程較長，皮疹及結膜充血發(fā)生率較高，冠狀動脈損害率更高(61.8%)(P<0.01)；IVIG-無效組血清IL-1β、Meprin A水平均顯著高于IVIG-有效組(P<0.01)； IVIG-無效組及IVIG-有效組兩組間WBC、CRP、ESR、NT-proBNP及MEP比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而Hb、PLT、ALT、ALB、HDL-C比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 IVIG-有效組與IVIG-無效組臨床特征及實驗室指標比較

2.4單因素進行ROC分析 在6項實驗室指標中，血Meprin A曲線下面積最大(0.911)，其次是NT-proBNP(0.831)及IL-1β(0.823)，見圖1。有統(tǒng)計學意義的臨床指標及實驗室指標對IVIG-無效型KD的診斷評價：NT-proBNP≥985.5 ng/L，預測IVIG-無效型KD的敏感性為74.5%，特異性為73.0%；Meprin A≥12.95 ng/ml，預測IVIG-無效型KD的敏感性為81.8%，特異性為89.6%；血清IL-1β≥4.05 pg/ml預測IVIG-無效型KD的敏感性為61.8%, 特異性為87.3%；當同時滿足Meprin A≥12.95 ng/ml及IL-1β≥4.05 pg/ml時，預測IVIG-無效型KD的敏感性60%，特異性94.9%。見表4。

圖1 6項指標ROC曲線

表4 臨床指標(熱程、IVIG應用時間)及實驗室指標對IVIG無效型KD的診斷效能

2.5Meprin A與其他實驗室指標的相關性分析 Spearman相關性分析發(fā)現Meprin A與IL-1β及NT-proBNP存在顯著的相關(r=0.635，P<0.01；r=0.785，P<0.01), 與WBC、CRP、ESR有一定的相關(r=0.341，P<0.01；r=0.374，P<0.01；r=0.373，P<0.01), 而與Hb、PLT、ALT、ALB、HDL-C無相關性，見表5。

表5 Meprin A與其他實驗室指標的相關性分析

3 討 論

KD是一種主要發(fā)生于兒童的非特異性全身血管炎性疾病，好發(fā)于5歲以下嬰幼兒，已成為兒童后天獲得性心臟病的原因之一。IVIG是KD的標準治療方法，可有效的縮短發(fā)熱時間，減少全身炎癥反應，減少冠狀動脈病變的發(fā)生[9]。但研究表明，有5%～38.3%的KD患者可出現IVIG-無反應，且CAL作為KD 最常見且最嚴重的并發(fā)癥，可能與IVIG-耐藥有關[3]。本研究中IVIG無效型的發(fā)生率為13.4%，其中IVIG-無效組冠狀動脈損害率高達61.8%。與IVIG-有效組比較，IVIG-無效組的CAL患病率增加了近5倍。IVIG-無效型KD冠狀動脈損害的高風險，可能與IVIG-無反應KD炎癥誘導更嚴重相關，但仍待進一步研究。

IVIG-無效型KD的發(fā)病機制尚不明確。目前認為IL-1β在KD的發(fā)病機制中起重要作用[10]，抑制IL-1β途徑以及阻斷IL-1β信號傳導可以抑制KD的發(fā)生發(fā)展[11]。本研究證實KD患兒急性期血清IL-1β水平明顯高于對照組及緩解期(P<0.05)，且與代表KD疾病活動性的實驗室指標ESR、CRP、WBC正相關，或可作為評估疾病活動性的有效指標。同時還發(fā)現IVIG-無效組患兒血清IL-1β水平明顯高于IVIG-有效組(P<0.05)。這提示IL-1β的水平可能決定對IVIG-的反應[4]。本研究再進一步發(fā)現當血清IL-1β≥4.05 pg/ml時預測IVIG無效型KD的敏感性及特異性均較高，因此推測IL-1β可作為IVIG無效型KD的預測指標之一。

在體外實驗及死亡KD患兒的尸檢中均發(fā)現冠狀動脈炎中存在CD8+T細胞浸潤[12-13]。同時研究還表明CD8+T淋巴細胞高度活化可能會引起IVIG的耐藥[14-15]，可見CD8+T細胞過度激活及其活化在IVIG-無效型KD發(fā)病及冠狀動脈損害的機制中發(fā)揮了重要作用。有研究提示IL-1β負責抗原驅動的CD8+ T細胞的分化，增殖，記憶以及向包括冠狀動脈壁在內的組織遷移[16-17]。因此，我們認為IL-1β可能通過介導CD8+T淋巴細胞活化的失衡及向冠狀動脈的遷移，參與IVIG-無效型KD的發(fā)生及其冠狀動脈損害。

本研究還發(fā)現KD患兒血清Meprin A水平明顯高于對照組(P<0.01)。內脂酶Meprins是一種含鋅金屬肽酶，包含α及β兩個亞單位，由不同的基因編碼。Meprin A是α亞基(α-α)的同二聚物或α和β亞基的異二聚體(α-β)[18-19]。Meprins具有水解內源性生長因子、血管活性肽、細胞因子和細胞外基質的功能[6]。研究表明，Meprin A在冠狀動脈粥樣硬化及冠心病等心血管疾病患者外周血中表達增加[20]。Kentsis等[7]發(fā)現在KD患者急性期血清中及KD伴冠狀動脈病變小鼠模型的冠狀動脈組織中同樣存在Meprin A水平升高，與本研究保持一致。同時通過對比KD患兒急性期及緩解期血清Meprin A水平，我們發(fā)現急性期血清中Meprin A表達明顯升高，并與KD疾病活動性相關的實驗室指標ESR、CRP、WBC呈正相關。且IVIG-無效組外周血循環(huán)中Meprin A的水平亦明顯高于IVIG-有效組(P<0.001)。當血清Meprin A≥12.95 ng/L時預測IVIG-無效型KD的敏感性及特異性均較高，因此推測Meprin A不僅可作為KD患兒疾病活動性的指標之一，同時還可預測IVIG-無效型KD。

已有研究表明Meprin-A可將IL-1β前體形式(pro-IL-1β)轉變?yōu)橛猩锘钚缘腎L-1β，同時除了水解IL-6使其失活外，又可通過裂解細胞膜上的IL-6R產生sIL-6R介導IL-6反信號傳遞，促進炎癥的發(fā)生發(fā)展[6]。IL-1β及IL-6高水平表達于在KD患兒外周血循環(huán)中，可能是KD致病及IVIG-無反應的重要炎性細胞因子。本研究發(fā)現Meprin A和IL-1β之間存在顯著相關(r=0.635，P<0.01)。且當同時滿足Meprin A≥12.95 ng/ml及IL-1β≥4.05 pg/m時，預測IVIG-無效型KD特異性可高達94.9%。故推測Meprin A可能通過調節(jié)炎癥介質如IL-6途徑的失衡及IL-1β的進一步釋放，參與IVIG-無效型KD的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述，Meprin A、IL-1β可能參與KD的致病過程，不僅可作為KD疾病活動性的良好指標，且可較好預測IVIG-無效型KD。當然我們仍需要進一步擴大樣量，建立組織細胞水平，分子水平實驗，進一步深入探討Meprin A、IL-1β在IVIG-無效型KD中的發(fā)病機制，以期能指導臨床。