徐 華, 陳 佳

(盤錦遼油寶石花醫(yī)院 a.檢驗科; b.全科醫(yī)學(xué)科, 遼寧 盤錦 124010)

原發(fā)性干燥綜合征(pSS)是一種常見的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，影響著全世界約3 500萬人[1]。在我國的發(fā)病率約為0.77%，男女比約為1∶9[2]。除引起外分泌腺、腎、關(guān)節(jié)和血液等器官、系統(tǒng)損害外，還增加了淋巴瘤的患病風(fēng)險[3-5]。但pSS初期癥狀輕微，加之缺乏敏感、特異的檢測指標，常被人們忽視，目前亦無特效治療藥物。因此，尋找能夠早期特異診斷pSS的標志物具有重要意義。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對pSS進行了許多研究，并發(fā)現(xiàn)了許多有益于診斷和治療生物標志物，但各研究間尚存較大差異，其具體發(fā)病機制仍未闡明。本研究為避免單一研究所引起的假陽性問題，通過對基因表達綜合系統(tǒng)(GEO)3個基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，獲得pSS組織與對照組織之間的差異基因，分析與pSS相關(guān)基因和信號通路，探討pSS可能的發(fā)生機制，并利用pSS相關(guān)基因篩選潛在治療藥物，為pSS的的進一步研究提供線索。

1 材料與方法

1.1GEO數(shù)據(jù)集獲取 基因表達綜合系統(tǒng)(GEO)下載GSE7451[6]、GSE40611[7]、GSE127952 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE127952) 3個原發(fā)性干燥綜合征基因表達數(shù)據(jù)作為分析數(shù)據(jù)集，同時下載GSE84844[8]做為hub基因驗證訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(見表1)。所有的數(shù)據(jù)都可以在網(wǎng)上免費獲取，這項研究不涉及任何作者對人類或動物進行的實驗。

1.2差異基因篩選 利用GEO2R在線分析工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2R/)分析pSS與非pSS樣本間的差異基因。移除沒有對應(yīng)基因的探針，當(dāng)有多個探針對應(yīng)同一個基因時，取最大表達值探針來作為基因的表達量。并以P<0.05且差異倍數(shù)|logFC|≥1.0作為差異基因的篩選條件。最后，使用韋恩圖web工具(bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取3個數(shù)據(jù)集差異基因的交集作為pSS的差異基因。

1.3差異基因分析與hub基因篩選 使用Metascape[9]數(shù)據(jù)庫對所得差異基因進行GO和KEGG功能富集分析。利用STRING數(shù)據(jù)庫分析差異基因編碼的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，選取交互作用評分大于0.4，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape[10]軟件進行可視化。通過CytoHubba[11]插件篩選hub基因。本研究選擇MCC得分前25個且度值>20的基因作為pSS的hub基因。同時，以GSE84844作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC)分析hub基因表達水平與pSS發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。用“pROC”包計算曲線下面積(AUC)值和相應(yīng)的95%置信區(qū)間(CI)。

1.4pSS潛在藥物篩選與藥物通路、靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上調(diào)和下調(diào)的差異基因映射到連接性圖譜(CMAP)數(shù)據(jù)庫[12]中，以富集分數(shù)≤-0.75和P<0.05為篩選標準，獲得針對所選差異基因的小分子藥物，作為pSS治療的候選藥物。為了進一步探討前10項藥物的潛在作用機制以及藥物與通路之間的關(guān)系，使用STITCH數(shù)據(jù)庫[13]來識別這些藥物的靶點，然后分析藥物靶點網(wǎng)絡(luò)，顯示前10名藥物與其對應(yīng)靶點之間的相互作用。利用DRUG-Path數(shù)據(jù)庫[14]獲得前10名候選藥物的路徑，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1差異基因篩選 以P<0.05且|logFC|≥1.0為篩選條件，在GSE7451中篩選出2 778個差異基因，其中上調(diào)基因1 407個，下調(diào)基因1 371個；在GSE40611中篩選出2 423個差異基因，1 071個基因上調(diào)，1 352個基因下調(diào)；在GSE127952中篩選出1 973個差異基因，1 017個上調(diào)基因和956個下調(diào)基因。隨后，通過對3組差異基因取交集，得到90個最終差異基因，其中79個顯著上調(diào)基因(圖1a)和11個下調(diào)基因(圖1b)。

2.2差異基因的功能富集分析 90個差異基因?qū)?MetaScape進行GO與KEGG富集分析。在生物學(xué)過程中，這些基因主要參與病毒防御應(yīng)答、多生物過程的調(diào)控、先天免疫應(yīng)答調(diào)控、對β干擾素的反應(yīng)和細胞對干擾素γ的反應(yīng)等。在細胞組分方面主要與細胞質(zhì)核周區(qū)、富含ficolin-1顆粒的內(nèi)腔、膜筏、初級內(nèi)體、三級顆粒等有關(guān)。在分子功能方面主要與半胱氨酸型內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)因子參與凋亡過程、細胞因子結(jié)合、GTP結(jié)合、酶激活劑活性、肌動蛋白結(jié)合和泛素樣蛋白連接酶結(jié)合有關(guān)。KEGG通路富集分析顯示，這些基因參與NOD樣受體信號通路、甲型流感、NF-kappa B信號通路、弓形蟲病和凋亡通路等。富集分析結(jié)果前10項(分子功能共6項)見圖2、表2。

表1 pSS患者與正常人組織芯片資料

圖1 差異基因韋恩圖與PPI網(wǎng)絡(luò)圖 a.上調(diào)差異基因；b.下調(diào)差異基因；c.差異基因與hub基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 GO和KEGG分析氣泡圖 a.生物過程; b.細胞成分; c.分子功能; d.KEGG途徑

表2 GO與KEGG分析結(jié)果

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與hub基因鑒定 將差異基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，得到90個節(jié)點和535個邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化分析.應(yīng)用cytohubba插件計算MCC評分和度值，最終確定19個基因為pSS預(yù)選hub基因，這些基因在pSS中均為上調(diào)基因(圖1c)。

用ROC曲線分析了19個基因在訓(xùn)練集GSE84844中對pSS的診斷價值。這些基因?qū)SS診斷具有較高的敏感性和特異性，對pSS的診斷具有一定的診斷價值，尤其是IFIH1與IFIT5的AUC>0.90，可作為pSS診斷的生物標記物，見表3，圖3。

2.4pSS潛在治療藥物篩選與分析 根據(jù)CMAP數(shù)據(jù)集的預(yù)測，15種得分≤-0.75的候選藥物被認為是治療pSS的潛在藥物。對得分最高的前10種藥物進行藥物途徑和藥物靶點分析，共有81條路徑顯著相關(guān)(圖4)。其中氟替卡松和氯唑西林分別對應(yīng)于嗅覺傳導(dǎo)、亨廷頓病、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、格蘭特對宿主病、造血細胞系、哮喘、移植排斥反應(yīng)、I型糖尿病、MAPK信號通路、抗原處理和呈現(xiàn)途徑。應(yīng)用STITCH數(shù)據(jù)庫預(yù)測前10名藥物的靶點，然而，數(shù)據(jù)庫中未能得到Prestwick-691的靶點。因此，僅提出了9個藥物靶點網(wǎng)絡(luò)。見表4，圖5。

圖3 IFIHI與IFIT5 ROC曲線圖(陰影部分表示置信水平)

表4 CMAP數(shù)據(jù)庫篩選的pSS治療藥物

圖4 藥物作用通路網(wǎng)絡(luò)圖：紅色節(jié)點代表藥物，藍色節(jié)點代表受藥物影響的通路

圖5 藥物的靶向網(wǎng)絡(luò)圖 a.氟替卡松；b.氯唑西林；c.萘呋胺酯；d.利多卡因；e.多西環(huán)素；f.右普萘洛爾(R-普萘洛爾)；g.噻嗎洛爾；h.2-氨基苯磺酰胺；i. 呋喃唑酮

3 討 論

pSS已成為世界三大自身免疫性疾病之一[15]，在世界不同地區(qū)的患病率為0.5%～1.5%[16-18]。盡管在揭示pSS發(fā)生發(fā)展的分子機制方面已經(jīng)取得了很多進展，但具體的機制還不清楚。已發(fā)表研究之間的不一致也很明顯[19]。因此，進一步研究對于驗證和更新所獲得的信息具有重要意義。本研究通過對3個基因表達數(shù)據(jù)分析得到了90個(79個上調(diào)，11個下調(diào))差異基因。之后，我們進行了GO/KEGG途徑富集分析。DEGs主要富集在NOD樣受體信號通路、甲型流感和細胞因子-細胞因子受體相互作用的信號通路中。免疫調(diào)節(jié)異常和細胞凋亡異常是pSS損傷腺體的重要機制之一[20]。核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體(NLRs)是一類參與調(diào)節(jié)自然免疫應(yīng)答和細胞死亡途徑的胞漿蛋白，細胞因子-細胞因子受體相互作用途徑是一種免疫相關(guān)的信號途徑，在炎癥宿主防御、細胞生長和分化中起著重要作用[21-22]。此外，病毒感染可以誘導(dǎo)宿主的自然免疫反應(yīng)，從而激活宿主模式識別受體介導(dǎo)的抗病毒信號通路，如Toll樣受體(TLRs)和RIG-I樣受體(RLRs)，可在多種機制的調(diào)控下誘導(dǎo)干擾素等細胞因子的表達[23]。這些信號通路可能有助于為pSS制定有效的治療策略。

本研究采用差異構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，并篩選了19 個hub基因：STAT1、MX1、ISG15、IFIH1、GBP1、IFIT1、XAF1、RSAD2、IFIT2、SAMD9L、TRIM22、IFIT3、IFI44L、HERC5、IFIT5、IFI44、IFI6、RTP4和ISG20。與非pSS組織相比，pSS中所選hub基因的表達均上調(diào)。在驗證hub基因時，我們使用獨立的數(shù)據(jù)集通過ROC曲線進行分析。這些基因?qū)SS診斷具有較高的診斷價值，尤其IFIH1與IFIT5的AUC>0.90，它們可能是pSS的良好預(yù)測指標。這19個基因中有多個是干擾素誘導(dǎo)基因，它們與抗病毒感染、天然免疫和誘導(dǎo)細胞凋亡等功能相關(guān)。IFN途徑的激活提示pSS與病毒感染有關(guān)[24]。在SLE、皮肌炎、銀屑病等不同疾病中，已有I型IFN途徑紊亂的報道，pSS患者的唇腺和外周血中IFN-α的表達也明顯增高[25-27]。IFN途徑的激活可能是pSS潛在的治療靶點。

基于pSS相關(guān)的差異基因進行潛在治療藥物預(yù)測，得到15種候選藥物，以期為pSS治療提供更多思路。本研究選取前10種藥物進行靶基因和藥物作用途徑分析。其中，氟替卡松(合成糖皮質(zhì)激素)和氯唑西林(苯唑西林氯化衍生物)的連接性得分相對較低。氟替卡松直接作用于NR3C1、IL5、DUSP1、CRP、PPARG、DUSP12、BDNF、GATA3、FN1和IL1B，調(diào)節(jié)嗅覺傳導(dǎo)、亨廷頓病和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子的信號通路；氯唑西林直接作用于ABCB11和OXA1L，除調(diào)節(jié)嗅覺轉(zhuǎn)化外，還參與調(diào)節(jié)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植物抗宿主病、造血細胞系、自身免疫性甲狀腺疾病、哮喘、移植物排斥反應(yīng)、Ⅰ型糖尿病、MAPK信號通路、抗原處理和遞呈信號通路。在本研究中它們是最佳的潛在治療pSS藥物。

本研究尚存一些局限性有待解決。首先，我們需要在體外進一步驗證分析所得的hub基因，并觀察其在pSS中的特異性作用。其次，通過Cmap數(shù)據(jù)庫預(yù)測的潛在治療藥物對pSS治療的影響有待進一步的實驗研究。綜上所述，本研究不考慮上述局限性，基于GEO數(shù)據(jù)庫的3個基因表達譜數(shù)據(jù)，在pSS中鑒定出90個DEGs，并通過GO和KEGG通路分析進一步探討pSS的潛在機制。此外，我們的研究預(yù)測了15種pSS候選藥物，為pSS診斷、治療的進一步研究提供了新的線索。